Utforma mikroflödessystem enheter för att studera cellulära svaren Under Singel eller samexisterande Chemical / Elektrisk / Shear stresstimuli
Summary
Micro-fabricated devices integrated with fluidic components provide an in vitro platform for cell studies mimicking the in vivo micro-environment. We developed polymethylmethacrylate-based microfluidic chips for studying cellular responses under single or coexisting chemical/electrical/shear stress stimuli.
Abstract
Mikrofluidanordningar är kapabla att skapa en exakt och styrbar cellulär mikromiljö av pH, temperatur, saltkoncentration, och andra fysikaliska eller kemiska stimuli. De har vanligen används för in vitro-studier cell genom in vivo som omgivningen. Speciellt hur celler svaret till kemiska gradienter, elektriska fält, och skjuvspänningar har dragit många intressen eftersom dessa fenomen är viktiga för att förstå cellulära egenskaper och funktioner. Dessa mikroflödes chips kan vara gjorda av glasunderlag, kiselskivor, polydimetylsiloxan (PDMS) polymerer, polymetylmetakrylat (PMMA) substrat, eller polyetylentereftalat (PET) substraten. Ut ur dessa material, PMMA substrat är billiga och kan enkelt bearbetas med användning av laserablation och skrivning. Även om ett fåtal mikroflödessystem enheter har konstruerats och tillverkas för att generera flera, samtidiga kemiska och elektriska stimuli, var ingen av dem ansestillräckligt effektiv för att minska experimentella upprepningar, särskilt vid screening. I denna rapport beskriver vi vår design och tillverkning av två PMMA-baserade mikroflödessystem marker för att undersöka cellulära svar, i produktionen av reaktiva syreradikaler och migration under enstaka eller samexisterar kemiska / elektriska / skjuvspänning stimuli. Den första chip genererar fem relativa koncentrationerna av 0, 1/8, 1/2, 7/8, och en i kulturregioner, tillsammans med en skjuvspänning gradient produceras inom vart och ett av dessa områden. Den andra chip genererar samma relativa koncentrationer, men med fem olika elektriska fältstyrkor som skapats inom varje odlingsområde. Dessa enheter ger inte bara celler med en exakt, reglerbar mikromiljön utan också kraftigt öka den experimentella genomströmning.
Introduction
In vivo-celler är omgivna av en mängd olika biomolekyler inklusive extracellulär matris (ECM), kolhydrater, lipider, och andra celler. De funktionalisera genom att svara på mikromiljö stimuli såsom interaktion med ECM och svar på kemiska gradienter av olika tillväxtfaktorer. Traditionellt är cell in vitro studier genomfördes i cellodlingsskålar där förbrukningen av celler och reagens är stort och celler växer i en statisk (icke-cirkulerande) miljö. Nyligen har mikrotillverkade anordningar integrerade med fluid komponenter gav en alternativ plattform för cellstudier på ett mer kontrollerbart sätt. Sådana anordningar är i stånd att skapa en exakt mikromiljö av kemiska och fysikaliska stimuli och samtidigt minimera förbrukningen av celler och reagens. Dessa mikroflödes chips kan vara gjorda av glasunderlag, kiselskivor, polydimetylsiloxan (PDMS) polymerer, polymetylmetakrylat (PMMA) substrat, eller polyethylenetereftalat (PET) substraten 1-3. PDMS-baserade enheter är transparenta, biokompatibla och genomträngligt för gaser, vilket gör dem lämpliga för långvarig cellodling och studier. PMMA och PET-substrat är billiga och lätta att bearbetas med användning av laserablation och skrivning.
Mikroflödessystem enheter bör ge celler med en stabil och kontrollerbar mikro miljö där cellerna är föremål för olika kemiska och fysikaliska stimuli. Till exempel är mikrofluidchips används för att studera kemotaxi av celler. I stället för traditionella metoder som använder Boyden kammare och kapillär 4,5 dessa miniatyriserade fluidanordningar kan generera exakta kemiska gradienter för att studera celler beteenden 1,6,7. Ett annat exempel är att studera cellernas riktnings migration enligt elektriska fält (EFS), ett fenomen som heter electrotaxis. Electrotactic beteenden av celler rapporterades vara relaterade till nervregeneration 8, embryonal utveckling 9,och sårläknings 10,11. Och många studier har genomförts för att undersöka electrotaxis av olika celltyper, inklusive cancerceller 12,13, lymfocyter 14,15, leukemiceller 11, och stamceller 16. Konventionellt petriskålar och täckglas används för att konstruera electrotactic kammare för att generera EF 17. Sådana enkla inställningar skapar problem medium avdunstning och oprecisa EF, men de kan övervinnas genom mikroflödessystem enheter av slutna, väldefinierade fluidic kanaler 12,18,19.
Att systematiskt studera cellulära svar enligt precisa, styrbara kemiska och elektriska stimuli, skulle det vara till stor nytta för att utveckla mikroflödessystem enheter som kan ge celler med flera stimuli samtidigt. Till exempel, Li et al. rapporterade en PDMS-baserade mikroflödessystem enhet för att skapa enkla eller samexisterande kemiska gradienter och EF 20. Kao et al. devrymt en liknande mikroflödes chip för att modulera kemotaxi av lungcancerceller av EF 6. Dessutom, för att öka genomströmningen, Hou et al. konstrueras och tillverkas en PMMA-baserad flerkana-dual-elektriskt fält chip för att ge celler med 8 olika kombinerade stimuli, som är (2 EF styrkor x 4 kemiska koncentrationer) 21. För att ytterligare öka hela och lägga skjuvspänningen stimulans, utvecklade vi två PMMA-baserade mikroflödessystem enheter för att studera cellulära svar under en enda eller samexisterande kemiska / elektriska / skjuvspänning stimuli.
Rapporterat av Lo et al. 22,23, dessa enheter innehåller fem oberoende cellodlings kanaler är föremål för kontinuerlig flödes flödande, härma cirkulationssystemet in vivo. I det första chipset (den kemiska-skjuvspänning chip eller CSS-chip), fem relativa koncentrationerna av 0, 1/8, 1/2, 7/8 och 1 alstras i odlingsområden, och en skjuvspänning gradient är producerad i vart och ett av de fem kulturområden. I den andra chip (den kemiska-elektriska fältet chip eller CEF-chip), genom användning av en enda uppsättning av elektroder och 2 sprutpumpar, är fem EF styrkor genereras utöver fem olika kemiska koncentrationer inom dessa odlingsområden. Numeriska beräkningar och simuleringar görs för att bättre design och driva dessa marker, och lungcancerceller odlade i dessa enheter är föremål för en eller samexisterande stimuli för att observera deras svar i förhållande till produktionen av reaktiva syreradikaler (ROS), migrationshastigheten, och migrationen riktningen. Dessa marker är visat sig vara tidsbesparande, hög genomströmning och pålitliga enheter för att undersöka hur celler svarar på olika mikro stimuli från omgivningen.
Protocol
Representative Results
Discussion
PMMA-baserade chips tillverkas med hjälp av laserablation och skrift som är billigare och enklare metoder i jämförelse med PDMS-baserade chips som kräver mer komplicerade mjuk litografi. Efter att utforma en mikroflödessystem chip, kan tillverkning och montering ske inom bara fem minuter. Det finns några viktiga steg att uppmärksamhet bör ägnas åt att utföra experimentet. Den första är "montera" fråga. Adaptrarna ska vara limmade på rätt sätt till den översta lagret av chipet. Lim kan läcka…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was financially supported by the Ministry of Science and Technology of Taiwan under Contract No. MOST 104-2311-B-002-026 (K. Y. Lo), No. MOST 104-2112-M-030-002 (Y. S. Sun), and National Taiwan University Career Development Project (103R7888) (K. Y. Lo). The authors also thank the Center for Emerging Material and Advanced Devices, National Taiwan University, for the use of the cell culture room.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-092 | Cell culture medium |
| Trypsin | Gibco | 25300-054 | detach cell from the dish |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10082147 | Cell culture medium |
| 10-cm cell culture Petri dish | Nunc | 150350 | Cell culture |
| Bright-Line Hemacytometer | Sigma | Z359629 | Cell Counting Equipment |
| PMMA | Customized | Customized | Microfluidic chip |
| Adaptor | Customized | Customized | Microfluidic chip |
| 0.07/0.22 mm double-sided tape | 3M | 8018/9088 | Microfluidic chip |
| Low melting point agarose | Sigma | A9414 | Salt bridge |
| 2'-7'-dichlorodihydrofluoresce diacetate | Sigma | D6883 | Intracellular ROS measurement |
| Indium tin oxide (ITO) glass | Merck | 300739 | Heater |
| Proportional-integral-derivative controller | JETEC Electronics Co. | TTM-J4-R-AB | Temperature controller |
| Thermal coupler | TECPEL | TPK-02A | Temperature controller |
| CO2 laser scriber | Laser Tools & Technics Corp. | ILS2 | Microfluidic chip fabrication |
| Syringe pumps | New Era | NE-300 | Pumping medium and chemicals into the chip |
| Power supply | Major Science | MP-300V | Supplying direct currents |
| Inverted microscope | Olympus | CKX41 | Monitoring cell migration |
| Inverted fluorescent microscope | Nikon | TS-100 | Monitoring cell migartion and fluorescencent signals |
| DSLR camera | Canon | 60D | Recording bright-field images |
| CCD camera | Nikon | DS-Qi1 | Recording fluorescent images |
| super glue | 3M Scotch | 7004 | Attaching adaptors to PMMA substrates |
| AutoCAD | Autodesk Inc. | Designing microfluidic chips | |
| DMSO | Sigma | D8418 | Dissolving DCFDA |
| ImgeJ | National Institutes of Health | Quantifying fluorescent intensities and cell migration |
References
- Cheng, J. Y., Yen, M. H., Kuo, C. T., Young, T. H. A transparent cell-culture microchamber with a variably controlled concentration gradient generator and flow field rectifier. Biomicrofluidics. 2, (2008).
- Terry, S. C., Jerman, J. H., Angell, J. B. Gas-Chromatographic Air Analyzer Fabricated on a Silicon-Wafer. Ieee T Electron Dev. 26, 1880-1886 (1979).
- Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annu Rev Biomed Eng. 3, 335-373 (2001).
- Adler, J. Chemoreceptors in bacteria. Science. 166, 1588-1597 (1969).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J Exp Med. 115, 453-466 (1962).
- Kao, Y. C., et al. Modulating chemotaxis of lung cancer cells by using electric fields in a microfluidic device. Biomicrofluidics. 8, 024107 (2014).
- Walker, G. M., et al. Effects of flow and diffusion on chemotaxis studies in a microfabricated gradient generator. Lab Chip. 5, 611-618 (2005).
- Al-Majed, A. A., Neumann, C. M., Brushart, T. M., Gordon, T. Brief electrical stimulation promotes the speed and accuracy of motor axonal regeneration. J Neurosci. 20, 2602-2608 (2000).
- Nuccitelli, R. Endogenous electric fields in embryos during development, regeneration and wound healing. Radiat Prot Dosim. 106, 375-383 (2003).
- McCaig, C. D., Rajnicek, A. M., Song, B., Zhao, M. Controlling cell behavior electrically: Current views and future potential. Physiol Rev. 85, 943-978 (2005).
- Tai, G., Reid, B., Cao, L., Zhao, M. Electrotaxis and wound healing: experimental methods to study electric fields as a directional signal for cell migration. Methods Mol Biol. 571, 77-97 (2009).
- Huang, C. W., Cheng, J. Y., Yen, M. H., Young, T. H. Electrotaxis of lung cancer cells in a multiple-electric-field chip. Biosens Bioelectron. 24, 3510-3516 (2009).
- Yan, X. L., et al. Lung Cancer A549 Cells Migrate Directionally in DC Electric Fields With Polarized and Activated EGFRs. Bioelectromagnetics. 30, 29-35 (2009).
- Li, J., et al. Activated T lymphocytes migrate toward the cathode of DC electric fields in microfluidic devices. Lab Chip. 11, 1298-1304 (2011).
- Lin, F., et al. Lymphocyte electrotaxis in vitro and in vivo. J Immunol. 181, 2465-2471 (2008).
- Zhang, J., et al. Electrically Guiding Migration of Human Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Rev. , (2011).
- Song, B., et al. Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo. Nat Protoc. 2, 1479-1489 (2007).
- Sun, Y. S., Peng, S. W., Cheng, J. Y. In vitro electrical-stimulated wound-healing chip for studying electric field-assisted wound-healing process. Biomicrofluidics. 6, 34117 (2012).
- Sun, Y. S., Peng, S. W., Lin, K. H., Cheng, J. Y. Electrotaxis of lung cancer cells in ordered three-dimensional scaffolds. Biomicrofluidics. 6, (2012).
- Li, J., Zhu, L., Zhang, M., Lin, F. Microfluidic device for studying cell migration in single or co-existing chemical gradients and electric fields. Biomicrofluidics. 6, 24121-2412113 (2012).
- Hou, H. S., Tsai, H. F., Chiu, H. T., Cheng, J. Y. Simultaneous chemical and electrical stimulation on lung cancer cells using a multichannel-dual-electric-field chip. Biomicrofluidics. 8, 052007 (2014).
- Lo, K. Y., Wu, S. Y., Sun, Y. S. A microfluidic device for studying the production of reactive oxygen species and the migration in lung cancer cells under single or coexisting chemical/electrical stimulation. Microfluid Nanofluidics. 20, 15 (2016).
- Lo, K. Y., Zhu, Y., Tsai, H. F., Sun, Y. S. Effects of shear stresses and antioxidant concentrations on the production of reactive oxygen species in lung cancer cells. Biomicrofluidics. 7, 64108 (2013).
- Cheng, J. Y., Wei, C. W., Hsu, K. H., Young, T. H. Direct-write laser micromachining and universal surface modification of PMMA for device development. Sensor Actuat B-Chem. 99, 186-196 (2004).
- Chen, J. J. W., et al. Global analysis of gene expression in invasion by a lung cancer model. Cancer Res. 61, 5223-5230 (2001).
- Shih, J. Y., et al. Collapsin response mediator protein-1 and the invasion and metastasis of cancer cells. J Natl Cancer I. 93, 1392-1400 (2001).
- Lu, H., et al. Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion. Anal Chem. 76, 5257-5264 (2004).
- Fried, L. E., Arbiser, J. L. Honokiol, a Multifunctional Antiangiogenic and Antitumor Agent. Antioxid Redox Sign. 11, 1139-1148 (2009).
- Chisti, Y. Hydrodynamic damage to animal cells. Crit Rev Biotechnol. 21, 67-110 (2001).
- Davies, P. F., Remuzzi, A., Gordon, E. J., Dewey, C. F., Gimbrone, M. A. Turbulent fluid shear stress induces vascular endothelial cell turnover in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 2114-2117 (1986).
- Zoro, B. J., Owen, S., Drake, R. A., Hoare, M. The impact of process stress on suspended anchorage-dependent mammalian cells as an indicator of likely challenges for regenerative medicines. Biotechnol Bioeng. 99, 468-474 (2008).
- Chin, L. K., et al. Production of reactive oxygen species in endothelial cells under different pulsatile shear stresses and glucose concentrations. Lab Chip. 11, 1856-1863 (2011).
- Tsai, H. F., Peng, S. W., Wu, C. Y., Chang, H. F., Cheng, J. Y. Electrotaxis of oral squamous cell carcinoma cells in a multiple-electric-field chip with uniform flow field. Biomicrofluidics. 6, 34116 (2012).
