CUBIC Protocol Visualiserer Protein Expression på enkelt celle oppløsning i Hele Mount hud preparater

Summary

Denne rapporten beskriver en CUBIC protokoll for å avklare fulle tykkelse muse hud biopsier, og visualisere protein uttrykk mønstre, prolifererende celler, og sebocyttene på celle-oppløsning i 3D. Denne metoden gjør det mulig nøyaktig vurdering av hud anatomi og patologi, og av unormale epidermal fenotyper i genmodifiserte mus linjer.

Abstract

Huden er avgjørende for å overleve. Det ytre epidermal lag består av interfollicular epidermis, som er et lagdelt plateepitel dekker det meste av kroppen vår, og epidermal vedheng som hårsekkene og svettekjertlene. Epidermis undergår regenerering gjennom hele livet, og som respons på skade. Dette er aktivert som K14-uttrykke basale epidermal stilk / stamcellepopulasjoner som er tett regulert av flere reguleringsmekanismer aktive innenfor epidermis og mellom epidermis og dermis. Denne artikkelen beskriver en enkel metode for å klargjøre full tykkelse musehud biopsier, og visualisere K14 protein uttrykk mønstre, Ki67-merket prolifererende celler, Nile Red-merket sebocytter, og DAPI atom merking ved enkelt celle oppløsning i 3D. Denne metoden gjør det mulig nøyaktig vurdering og kvantifisering av hud anatomi og patologi, og av unormale epidermal fenotyper i genmodifiserte mus linjer. Den CUBIC protokollen er the beste metoden tilgjengelig for å date for å undersøke molekylære og cellulære interaksjoner i full tykkelse hud biopsier på enkelt celle oppløsning.

Introduction

Huden er avgjørende for å overleve. Det består av tre hoved lag de ytre epidermis, dermis og hypodermis. Overhuden er en meget regenererende vev. Det er en squamous stratifisert epitel, som hovedsakelig består av keratinocytter. Keratinocytter er født i basal laget, og bevege seg oppover gjennom suprabasal lag mens differensiering, og til slutt de er utgytt i det ytre forhomede lag en måned etter fødselen. Overhuden utvikler en rekke vedheng inkludert hårsekkene og talgkjertler. Hårsekkene også regenerere i en syklisk måte gjennom hele livet ^en. Evne til reproduksjon av epidermis er aktivert ved tilstedeværelsen av stamceller og forløperceller som er lokalisert i basallaget av epidermis og interfollicular hårsekken ^2.

Mange signalveier har vært innblandet i epidermal utvikling og fornyelse. Noen av disse forekommer innenforepidermis, som f.eks the Hedgehog veien. Andre signal arrangementer finner sted mellom dermis og epidermis ^3. For eksempel er wnt signaler fra dermis antas å være viktig for hårsekken utvikling, og de ​​utskilles av dermal papilla ved begynnelsen av anagen å aktivere hårsekken bule stilk / forløper- celle-proliferasjon og hårsekken vekst ^4. Det er viktig å forstå de cellulære og molekylære mekanismer som styrer epidermal utvikling og fornyelse for å bedre forstå hvordan de kan bli forstyrret i regenerativ hudsykdom som hudkreft.

Denne artikkelen beskriver en C lear, U nobstructed B regn I maging cocktailer og C omputational analyse (CUBIC) protokoll ^5-7 for å klargjøre hele mount hud preparater, og visualisere protein uttrykk mønstre i 3 dimensjoner ved enkelt celle oppløsning av konfokal mikroskopi. Den CUBIC metoden innebærer nedsenking av hudvevet i to aminoalkoholkjemi baserte kjemiske cocktails. Disse løsningene justeres brytningsindeksene i huden prøven, slik at vev gjennomsiktig og proteinene intakt, slik at immundeteksjon ved enkelt celle oppløsning.

Ved hjelp av denne CUBIC protokollen, basal og prolifererende keratinocytt populasjoner i interfollicular epidermis og i hårsekken ble fotografert i sin helhet tykkelse hud biopsier av villtype mus ved hjelp av anti-Keratin14 (K14) og anti-Ki67 antistoffer. Talgkjertler i villtype hud biopsier ble også visualisert ved hjelp av Nile Red farging. Til slutt ble de basale keratinocytt populasjoner i hvete og hyperplastiske YAP2-5SA-A C hud biopsier forhold ^åtte.

Dette CUBIC protokollen gjør det mulig visuell vurdering av protein uttrykk i full tykkelse hud biopsier på enkelt celle oppløsning, og er et viktig verktøy for å sette pris på epidermal anatomi og morfologiske defekter i huden av genmodifisertmus, og for å undersøke de cellulære og molekylære mekanismer bak epidermal utvikling og fornyelse.

Protocol

Etikk Uttalelse: Alle prosedyrer som involverer dyr fag følge retningslinjene i Animal Care og etisk komité (ACEC) ved UNSW Australia under godkjente ACEC protokoll 13 / 64B. 1. Klargjøring av Transparent Mouse huden vev Merk: Alle mus brukt i denne studien var på C57BL / 6 genetisk bakgrunn Innsamling av mus hud vev. Humant avlive mus ved halshugging. fjerne hårene forsiktig fra det aktuelle hudområdet med en trimmer tar seg i…

Representative Results

Full tykkelse rygg hud biopsier av voksne villtype mus ble avklart, farget med et antistoff bindende basal keratinocyte markør Keratin14 (K14), og kjerner ble kontra med DAPI flekker løsning (figur 2 og Movie 1). DAPI-positive kjerner var synlige gjennom prøven (figur 2A, C), og K14 flekker var synlig utelukkende i en celle tykt basal laget av interfollicular epidermis, og skisserte talgkjertler (svarte asterisker), de ytre rot sheaths h?…

Discussion

De regulatoriske mekanismer som styrer hud utvikling og homeostase er mest studert i 2D ved hjelp av vev seksjonering og histologisk farging eller merking med antistoffer, som gjør at bare en begrenset forståelse av hud morfologi, cellepopulasjoner eller protein uttrykk. Et antall fremgangsmåter er blitt utviklet for å forbedre synliggjøring av den romlige organisering av celler og proteiner ved enkelt celle oppløsning i 3 dimensjoner i epidermale hele monteringer ^10-13. Noen av disse er imidlertid invo…

Materials

Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6418
Ethanol 96% (undenaturated)	Chem-supply	UN1170
Nile Red	Sigma-Aldrich	72485-100MG
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Roche	10236276001
N,N,N’,N’-tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylenediamine	Merck Millipore	821940
Polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether	Merck Millipore	648462
Triton X-100	Merck Millipore	648462
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound	Tissue-Tek	4583
anti-Keratin14 antibody	Covance	PRB-155P
anti-Ki67 antibody	Abcam	ab16667
Donkey anti-rabbit Alexa 594	Life Technologies	A21207
Dimethylsulfoxide	Sigma-Aldrich	D2650
Urea	Merck Millipore	66612
2,2′,2′’-nitrilotriethanol	Merck Millipore	137002
Confocal Microscope	Nikon Instruments Inc	Nikon A1 – Confocal Microscope
cruZer6 Face Trimmer	Braun	Braun cruZer6 Face
Sodium azide	Sigma-Aldrich	438456