Behavioral assays provide powerful tools for understanding neuronal function. Here we present several protocols for quantifying predatory feeding behavior found in the model nematode Pristionchus pacificus and its relatives. Additionally, we provide methods for analyzing predatory feeding adaptations including mouth structures and teeth.
This protocol provides multiple methods for the analysis and quantification of predatory feeding behaviors in nematodes. Many nematode species including Pristionchus pacificus display complex behaviors, the most striking of which is the predation of other nematode larvae. However, as these behaviors are absent in the model organism Caenorhabditis elegans, they have thus far only recently been described in detail along with the development of reliable behavioral assays 1. These predatory behaviors are dependent upon phenotypically plastic but fixed mouth morphs making the correct identification and categorization of these animals essential. In P. pacificus there are two mouth types, the stenostomatous and eurystomatous morphs 2, with only the wide mouthed eurystomatous containing an extra tooth and being capable of killing other nematode larvae. Through the isolation of an abundance of size matched prey larvae and subsequent exposure to predatory nematodes, assays including both “corpse assays” and “bite assays” on correctly identified mouth morph nematodes are possible. These assays provide a means to rapidly quantify predation success rates and provide a detailed behavioral analysis of individual nematodes engaged in predatory feeding activities. In addition, with the use of a high-speed camera, visualization of changes in pharyngeal activity including tooth and pumping dynamics are also possible.
Nematoder med deres små, men komplekse nervesystem har vist sig stærke værktøjer til at forstå mange aspekter af neurobiologi, herunder adfærd. Meget af denne forskning har fokuseret på modelorganismen Caenorhabditis elegans, hvor et væld af forskellige adfærdsmønstre med succes er blevet dissekeret og analyseret. Disse omfatter mechanosensory 3, kemotaktisk 4, thermotactic 5,6 og magnetotactic 7 påvirke parring 8,9, læring 10 og fodring behaviors 11. Men andre mere fjernt beslægtede nematodeart vise adfærd, som ikke er observeret i rhabditid C. elegans eller alternativt vise yderligere niveauer af kompleksitet, hvilket rejser relevante spørgsmål vedrørende deres udvikling og regulering. Kan observeres et tilfælde af dette i fjernt beslægtet diplogastrid nematode Pristionchus pacificus, som viser meget mere kompleks fodring værehaviors og rytmer, end der er observeret i C. elegans 1. Dette er på trods af de to arter deler homologe svælg neuroner 12. Sammenfaldende med disse yderligere fodring adfærd, P. pacificus viser også et udvidet kosten rækkevidde, da de er ivrig rovdyr, i stand til at supplere deres bakterielle kost ved også fodring på larver af andre nematoder. Heldigvis P. Pacificus er udviklet som en model for komparativ og integrativ evolutionær biologi og derfor mange molekylære og genetiske værktøjer er nu tilgængelige. Disse omfatter et fuldt sekventeret og kommenteret genom 13, molekylære og genetiske værktøjer, herunder transgener 14 og CRISPR / Cas9 15,16 samt en detaljeret og godt kommenteret fylogeni 17 med over 25 nært beslægtede arter, herunder sine nyopdagede søster arter. Desuden økologi talrige Pristionchus arter herunder P. Pacificus er vill defineres med mange arter der nu er blevet beskrevet deler en necromenic forening med Scarab biller, en vært de ofte deler med andre nematodeart 18. P. Pacificus giver derfor et glimrende modelsystem med til at dissekere udviklingen af nye adfærd og deres økologiske betydning.
For at analysere aggressiv fodring adfærd i nematodearter såsom P. Pacificus vi udviklet flere nye adfærdsmæssige assays for let observation og kvantificering af røveriske handlinger. Som P. Pacificus viser en dimorfe mund struktur, som i høj grad påvirker aggressiv adfærd, identifikation af den korrekte morphotype er afgørende 1,2. Den smalle mouthed stenostomatous morph indeholder en enkelt stump dorsal tand og ikke udøve nogen aggressiv fodring. Alternativt vid hals eurystomatous morf omfatter et meget større klo formet dorsale tand og en ekstra modståendesub-ventrale tand, der tilsammen fungerer effektivt åbne neglebånd af deres bytte. Forholdet mellem aggressiv eurystomatous til den ikke-aggressiv stenostomatous formular varierer blandt Pristionchus arter og også inden for P. pacificus imidlertid procentdelen af eurystomatous munden morph i P. pacificus vildtypestamme (PS312) er normalt 70 – 90% 2. Derudover kan de munden danner nøgletal svinger afhængigt af forskellige miljømæssige påvirkninger (begge kendt, herunder sult og nogle lille molekyle signalering samt ukendte faktorer), således korrekt identifikation og isolering af aggressiv eurystomatous munden formular er afgørende for en vellykket aggressiv analyser.
Sideløbende beskrivelsen af aggressiv munden formularen har vi udviklet en "bid assay" for direkte observation og kvantificering af røveriske adfærd, herunder bidende, drab og fodring begivenheder. Her byttedyr nematoder isoleres gennem filtering af nyligt udsultede kulturer og udsat for aggressiv voksen P. Pacificus, der observeres sammen over en kort tidshorisont. Derudover har vi også udviklet en high throughput "liget assay" for at lette hurtig screening af aggressiv adfærd ved indirekte observation af røveriske begivenheder. Dette drager fordel af tilstedeværelsen af larvestadium lig som et redskab til at screene for predation. Begge analyser giver nem og meget repeterbare metoder til at observere og måle aggressiv adfærd i nematode arter, såsom P. Pacificus.
Nematoder er et effektivt system til at forstå neurobiologi og adfærd med C. elegans hidtil er den primære værktøj. Dog, mange nematoder arter, herunder P. Pacificus display adfærd, som er fraværende eller varierer i kompleksitet fra modelorganismen C. elegans og derfor rejser fascinerende spørgsmål vedrørende udviklingen og reguleringen af disse adfærdsmønstre. En sådan ekstra adfærd findes i mange andre nematodeart herunder P. Pacificus er evnen til at supplere deres bakteriel kost ved at engagere sig i aggressiv fodring 1, 20. Vi har derfor udviklet og beskrevet en detaljeret protokol til nem og hurtig karakterisering af disse tidligere unanalyzed aggressiv adfærd i nematoder.
For det første har vi tilvejebragt fremgangsmåder til screening for ændringer i fodring apparatur som nematode munden. Identifikationen af den korrekte mund type er et vigtigt første sTEP for en vellykket prædation analyser som, i hvert fald inden for Pristionchus slægten kun eurystomatous dyr er i stand til aggressiv fodring. Det er bedst at identificere munden morphs med "hurtig munden fænotypebestemmelse" protokollen beskrevet i protokol 1.2 da denne metode er langt mindre invasiv og derfor er det mindre sandsynligt, at aggressiv adfærd kan forstyrres. Det anbefales dog, at først blive fortrolig med de forskellige munden strukturer ved identifikation med bedøvede dyr på agar pads (protokol 1.1).
Efter identifikation af den ønskede munden morph, har vi beskrevet to assays til kvantificering aggressiv fodring. Disse er en hurtig, high throughput "liget assay" (protokol 3) og en mere tidskrævende, men mere dybdegående adfærdsanalyse gennem "bid-analysen" (protokol 2). Begge disse protokoller er meget fleksible tillader adskillige modifikationer for at optimere assayene afhængigt af Experimenlæggende krav. For bite assays under anvendelse P. Pacificus rovdyr på C. elegans bytte, observationer af aggressiv adfærdsmæssige interaktioner for et tidsvindue på 10 min var tilstrækkelig til at kvantificere en betydelig mængde af bites sammen med andre fodring begivenheder. For "liget analyser" igen udnytte P. Pacificus rovdyr på C. elegans bytte, 5 rovdyr for 2 timer producerede let kvantificerbare og konsekvente liget tal giver mulighed for hurtig adfærdsanalyse. Imidlertid bør det bemærkes, forskellige arter af aggressiv nematode spil i forskellige hastigheder, spise med forskellige hastigheder og generelt udviser en stor mangfoldighed i andre funktionsmåder 1. Derudover kan forskellige byttedyr også spises på forskellige satser for tilsvarende grunde. Det anbefales derfor at optimere assays baseret på de testede både som rovdyr og byttedyr nematode arter, og også for eventuelle forskelle i miljøforholdene. Under både "bid" og "korpse "analyser er det afgørende, at både bytte og rovdyr er sunde, som understreget eller tilskadekomne rovdyr vil ikke dræbe effektivt. Desuden frisk assayplader er afgørende som ældre plader kan blive tørret ud som krænker sundheden for nematoderne fører til fejlagtige assays. det er også håbet, at fremtidige gentagelser af disse aggressiv analyser vil være i stand til at drage fordel af de seneste teknologiske fremskridt med henblik på at automatisere meget af analysen som er blevet gennemført for at undersøge mange adfærd observeret i C. elegans 21, 22. i øjeblikket problemer vil kunne opstå i nematoder såsom P. Pacificus som de vises meget mere følsomme til at kontakte, hvilket gør isolering og immobilisering i mikrofluide kamre, der kan ophæve aggressiv fodring. overvinde dette kan vise sig udfordrende, men vil lette individuelle nematoder skal screenes for nuanceret aggressiv adfærd.
Endelig har vi også tilvejebragt fremgangsmåder for undersøge nematode fodring apparatet selv lette sammenligninger mellem aggressiv og bakterielle fodring tilstande ved at kvantificere tand og svælg pumpe kinetik ved hjælp af en high-speed kamera (protokol 4). Kvantificeringen af pharyngeal pumpehastigheder i C. elegans er blevet anvendt til at overvåge fodring i mange år 23 imidlertid C. elegans mangler enhver form for munden denticle og også mangler aggressiv adfærd. Ved at kombinere en kvantificering af pharyngeal pumpning med den for tand aktivitet, kan ethvert innervation af tænderne specifikke for predation ligeledes iagttages. På grund af forstørrelsen forpligtet til at overholde tanden bevægelse dyrene bevæger sig ofte ud af fokusplanet, og dermed er det normalt kun er muligt at observere tand for korte tidsvinduer. Derudover, i modsætning til C. elegans, svælget af P. Pacificus ikke kontinuerligt pumpe, snarere den går i perioder med pumpning og fodring. Derfor, for præcis svælg pumping satser mens fodring skal bestemmes, er det vigtigt at registrere 15 sek kontinuerlig fodring.
Disse metoder præsenteres her giver derfor de første rammer for at efterforske aggressiv adfærd i nematoder systemer. Desuden kan de også kunne tilpasses til brug i efterforskningen andre interaktioner inden for nematode økosystem, herunder indflydelsen af yderligere økologisk relevante organismer på prædation herunder mikroorganismer, svampe og mider . de giver således et middel til at dissekere hvordan disse røveriske adfærd er reguleret, hvordan de kan have udviklet sig, og også deres økologiske betydning.
The authors have nothing to disclose.
We thank Dr. Daniel Bumbarger for the predation behavior picture. This work was funded by the Max-Planck Society.
Nylon net filters (20 um) | Merck Millipore Ltd | NY2004700 | Used to filter worms just leaving larvae for use as prey. |
PP Funnel for filter (54mm) | Duran | 292215003 | Used to filter worms just leaving larvae for use as prey. |
Small petri dish (35/10 mm) | Greiner Bio-One | 627102 | For imaging on High speed camera |
Zeiss SteREO Discovery V12 | For mouth form identificaton | ||
Axio-Imager A1 | For mouth form identificaton | ||
Glass Slides | Roth | H869 | |
Cover Slips | Roth | 657 | |
Motion Scope M3 Highspeed camera | IDT | High speed camera | |
Video zoom 44 ENG 1/2" 0.5x to 2.4x | Zeis | 452984-0000-000 | High speed camera zoom |
Nematode Growth Medium (NGM) ingredients: | |||
Agar | Roth | 5210.2 | CAS-Nr. 9002-18-0 |
Sodium chloride (NaCl) | Roth | 3957 | CAS-Nr. 7647-14-5 |
Bacto Tryptone | BD | 211699 | Lot 4316614 |
Calcium chloride dihydrate (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C3306 | CAS-Nr. 10035-04-8 |
Cholesterol from lanolin | Sigma-Aldrich | F 26732 00050 | CAS-Nr. 57-88-5 |
Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4) | Merck | 1,058,861,000 | CAS-Nr. 10034-99-8 |
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | ACROS organics | 271080025 | CAS-Nr. 7778-77-0 |
6 cm petri dish | Greiner Bio-One | 628102 | |
3.5 cm petri dish | Greiner Bio-One | 627102 | |
M9 ingredients: | |||
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | ACROS organics | 271080025 | CAS-Nr. 7778-77-0 |
Sodium hydrogen phosphate heptahydrate (NaHPO4) | Sigma-Aldrich | S9390-500G-D | CAS-Nr. 7782-85-6 |
Sodium chloride (NaCl) | Roth | 3957 | CAS-Nr. 7647-14-5 |