Den Terroir Concept Tolket gjennom Grape Berry Metabolomics og transcriptomics
Summary
Denne artikkelen beskriver anvendelsen av uønskede metabolomics, transcriptomics og multivariat statistisk analyse til drue bær utskrifter og metabolitter for å få innsikt i terroir-konseptet, dvs. virkningen av miljøet på bær kvalitetsegenskaper.
Abstract
Terroir refererer til kombinasjonen av miljøfaktorer som påvirker egenskapene til avlinger som grapevine (Vitis vinifera) i henhold til bestemte naturtyper og forvaltningspraksis. Denne artikkelen viser hvordan enkelte terroir signaturer kan påvises i bær metabolomet og transkriptom av grapevine sorten Corvina hjelp multivariat statistisk analyse. Metoden krever først en hensiktsmessig prøvetakingsplan. I dette tilfellet studien ble en spesiell klone av Corvina sorten valgt å minimalisere genetiske forskjeller, og prøvene ble samlet inn fra sju vinmarker som representerer tre ulike makrosonene ved tre ulike vekstsesonger. En vilkårlige LC-MS metabolomics tilnærming anbefales på grunn av sin høye følsomhet, ledsaget av effektiv databehandling ved hjelp MZmine programvare og en metabolitt identifikasjon strategi basert på fragmentering treet analyse. Omfattende transkriptomet analyse kan oppnås ved hjelp av mikromatriserinneholdende prober som dekker ~ 99% av alle forutsagte Grapevine gener, slik at den samtidige analyse av alle differensielt uttrykte gener i sammenheng med forskjellige terroirs. Endelig kan multivariat dataanalyse basert på projeksjonsmetoder benyttes for å overvinne den sterke årgang-spesifikk effekt, slik at metabolomikk og transcriptomics data som skal integreres, og analysert i detalj for å identifisere informative korrelasjoner.
Introduction
Storskala dataanalyse basert på genomene, transcriptomes, proteom og metabolomes av planter gir enestående innsikt i virkemåten av komplekse systemer, for eksempel terroir egenskapene av vin som reflekterer interaksjoner mellom Grapevine planter og deres omgivelser. Fordi terroir av en vin kan være tydelig selv når identiske grapevine kloner er dyrket i forskjellige vingårder, er genomikk analyse av liten nytte fordi klonale genomer er identiske. I stedet er det nødvendig å se på sammenhengen mellom genekspresjon og de metabolske egenskaper til de bær, som bestemmer kvalitetsegenskaper vin. Analyse av genekspresjon ved nivået for de transkriptom utbytte av de tilsvarende kjemiske egenskaper av alle transkripter, noe som letter kvantitativ analyse ved å utnytte universelle egenskaper som for eksempel hybridisering til immobiliserte prober på mikromatriser. I motsetning, universelle analytiske metoder i proteomikk ennd metabolomics er mer utfordrende på grunn av den enorme fysiske og kjemiske mangfold av individuelle proteiner og metabolitter. I tilfelle av metabolomics dette mangfoldet er enda mer ekstrem fordi enkelte metabolitter varierer enormt i størrelse, polaritet, overflod og volatilitet, slik at ingen enkelt utpakkingen eller analysemetoden tilbyr en helhetlig tilnærming.
Blant de analytiske plattformer som egner seg for ikke-flyktige metabolitter, de som er basert på høy ytelse væskekromatografi koblet til massespektrometri (HPLC-MS) er mye mer sensitiv enn alternativer som for eksempel HPLC med ultrafiolett eller diodegruppedetektorene (HPLC-UV, HPLC-DAD ) eller kjernemagnetisk resonans (NMR) spektroskopi, men kvantitativ analyse ved hjelp av HPLC-MS kan påvirkes av fenomener som matrise effekt og ion undertrykkelse / forbedring 1-3. Etterforskningen av slike effekter under analysen av Corvina drue bær ved HPLC-MS ved hjelp av en elektro ionisering kilde (HPLC-ESI-MS) viste at sukkerarter og andre molekyler som har lavest retensjonstider var sterkt underreported, sannsynligvis også gjenspeiler det store antall molekyler i denne sonen, og at overflod av andre molekyler kan være underestimert, overvurdert eller upåvirket av matrisen virkning , men dataene normalisering for matrisen effekten syntes å ha begrenset effekt på den samlede resultatene 4,5. Fremgangsmåten beskrevet her er optimalisert for analyse av middels polaritet metabolitter som samler seg ved høye nivåer i drue bær under modning, og som er betydelig påvirket av terroir. De omfatter anthocyaniner, flavonols, flavan-3-OLS, procyanidins, andre flavonoider, resveratrol, stilbenes, hydroxycinnamic syrer og hydroksybenzosyre syrer, som til sammen bestemmer farge, smak og helsemessige egenskaper av viner. Andre metabolitter, slik som sukker og alifatiske organiske syrer, blir ignorert fordi kvantifisering ved HPLC-MS er upålitelig på grunn av matrisen effekt og ion undertrykkelse fenomener fem. Innenfor polaritet utvalg valgt av denne metoden, er den tilnærmingen vilkårlige i at det tar sikte på å oppdage så mange forskjellige metabolitter som mulig 6.
Transcriptomics metoder som tillater tusenvis av grapevine utskrifter som skal overvåkes samtidig er tilrettelagt av tilgjengeligheten av hele grapevine genomsekvens 7,8. Tidlig transcriptomics metoder basert på high-throughput cDNA sekvense har utviklet seg med bruk av neste generasjons sekvensering til en samling av prosedyrer kollektivt beskrevet som RNA-Seq teknologi. Denne tilnærmingen er raskt blitt den foretrukne metode for å transcriptomics studier. Men en stor mengde litteratur basert på microarray, som tillater tusenvis av vitnemål som skal kvantifiseres i parallell ved hybridisering, har samlet for grapevine. Faktisk, før RNA-Seq ble en mainstream teknologi, hadde mange dedikerte kommersielle microarray plattformer værtutviklet slik at grapevine transkriptomet å bli inspisert i stor detalj. Blant de aller rekke plattformer, bare to lov genome-wide transkriptomet analyse ni. Den mest utviklet matrisen tillot hybridisering av opp til 12 uavhengige utvalg på en enkelt enhet, og dermed redusere kostnadene ved hvert forsøk. De 12 subgrupper hver omfattet 135.000 60-mer sonder som representerer 29,549 grapevine transkripsjoner. Denne enheten har blitt brukt i et stort antall studier 10-24. Disse to plattformene er nå avviklet, men en ny tilpasset microarray har nylig blitt utviklet og representerer en nyere utvikling som den inneholder et enda større antall sonder som representerer flere nylig oppdagede grapevine gener 25.
De store-salg datasett produsert av transcriptomics og metabolomics analyser krever egnede statistiske metoder for dataanalyse, inkludert multivariate teknikker for å analysere sammenhenger mellom ulike skjemas av data. De mest brukte multivariate teknikker er de basert på projeksjon, og disse kan være uten tilsyn, for eksempel prinsipal komponent analyse (PCA), eller overvåket, for eksempel toveis ortogonal projeksjon til latente strukturer diskriminant analyse (O2PLS-DA) 26. Protokollen som presenteres i denne artikkelen benytter PCA for utforskende dataanalyse og O2PLS-DA til å identifisere forskjeller mellom grupper av prøver.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne artikkelen beskriver metabolomics, transcriptomics og statistiske analyseprotokoller som brukes til å tolke drue bær terroir-konseptet. Metabolomics analyse ved hjelp av HPLC-ESI-MS er følsom nok til å påvise et stort antall metabolitter samtidig, men relativ kvantitering påvirkes av matrisen effekt og ion undertrykkelse / ekstrautstyr. Imidlertid har en lignende tilnærming allerede blitt brukt for å beskrive modning og post-harvest visne av Corvina bær, og korrigering av matrix effekter hatt en begrenset…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work benefited from the networking activities coordinated within the EU-funded COST ACTION FA1106 “An integrated systems approach to determine the developmental mechanisms controlling fleshy fruit quality in tomato and grapevine”. This work was supported by the ‘Completamento del Centro di Genomica Funzionale Vegetale’ project funded by the CARIVERONA Bank Foundation and by the ‘Valorizzazione dei Principali Vitigni Autoctoni Italiani e dei loro Terroir (Vigneto)’ project funded by the Italian Ministry of Agricultural and Forestry Policies. SDS was financed by the Italian Ministry of University and Research FIRB RBFR13GHC5 project “The Epigenomic Plasticity of Grapevine in Genotype per Environment Interactions”.
Materials
| Mill Grinder | IKA | IKA A11 basic | |
| HPLC Autosampler | Beckman Coulter | - | System Gold 508 Autosampler |
| HPLC System | Beckman Coulter | - | System Gold 127 Solvent Module HPLC |
| C18 Guard Column | Grace | - | Alltima HP C18 (7.5×2.1mm; 5μm) Guard Column |
| C18 Column | Grace | - | Alltima HP C18 (150×2.1mm; 3μm) Column |
| Mass Spectometer | Bruker Daltonics | - | Bruker Esquire 6000; The mass spectometer was equipped with an ESI source and the analyzer was an ion trap. |
| Extraction solvents and HPLC buffers | Sigma | 34966 | Methanol LC-MS grade |
| Sigma | 94318 | Formic acid LC-MS grade | |
| Sigma | 34967 | Acetonitrile LC-MS grade | |
| Sigma | 39253 | Water LC-MS grade | |
| Minisart RC 4 Syringe filters (0.2 μm) | Sartorius | 17764 | |
| Softwares for data collection (a) and processing (b) | Bruker Daltonics | – | Bruker Daltonics Esquire 5.2 Control (a); Esquire 3.2 Data Analysis and MzMine 2.2 softwares (b) |
| Spectrum Plant Total RNA kit | Sigma-Aldrich | STRN250-1KT | For total RNA extractino from grape pericarps |
| Nanodrop 1000 | Thermo Scientific | 1000 | |
| BioAnalyzer 2100 | Agilent Technologies | G2939A | |
| RNA 6000 Nano Reagents | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
| RNA Chips | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
| Agilent Gene Expression Wash Buffer 1 | Agilent Technologies | 5188-5325 | |
| Agilent Gene Expression Wash Buffer 2 | Agilent Technologies | 5188-5326 | |
| LowInput QuickAmp Labeling kit One-Color | Agilent Technologies | 5190-2305 | |
| Kit RNA Spike In – One-Color | Agilent Technologies | 5188-5282 | |
| Gene Expression Hybridization Kit | Agilent Technologies | 5188-5242 | |
| RNeasy Mini Kit (50) | Qiagen | 74104 | For cRNA Purification |
| Agilent SurePrint HD 4X44K 60-mer Microarray | Agilent Technologies | G2514F-048771 | |
| eArray | Agilent Technologies | – | https://earray.chem.agilent.com/earray/ |
| Gasket slides | Agilent Technologies | G2534-60012 | Enable Agilent SurePrint Microarray 4-array Hybridization |
| Thermostatic bath | Julabo | – | |
| Hybridization Chamber | Agilent Technologies | G2534-60001 | |
| Microarray Hybridization Oven | Agilent Technologies | G2545A | |
| Hybridization Oven Rotator Rack | Agilent Technologies | G2530-60029 | |
| Rotator Rack Conversion Rod | Agilent Technologies | G2530-60030 | |
| Staining kit | Bio-Optica | 10-2000 | Slide-staining dish and Slide rack |
| Magnetic stirrer device | AREX Heating Magnetic Stirrer | F20540163 | |
| Thermostatic Oven | Thermo Scientific | Heraeus – 6030 | |
| Agilent Microarray Scanner | Agilent Technologies | G2565CA | |
| Scanner Carousel, 48-position | Agilent Technologies | G2505-60502 | |
| Slide Holders | Agilent Technologies | G2505-60525 | |
| Feature extraction software v11.5 | Agilent Technologies | – | inside the Agilent Microarray Scanner G2565CA |
| SIMCA + V13 Software | Umetrics |
References
- Jessome, L. L., Volmer, D. A. Ion suppression: A major concern in mass spectrometry. Lc Gc N Am. 24 (5), 498-510 (2006).
- Kim, H. K., Choi, Y. H., Verpoorte, R. NMR-based plant metabolomics: where do we stand, where do we go?. Trends Biotech. 29 (6), 267-275 (2011).
- Sumner, L. W., Mendes, P., Dixon, R. A. Plant metabolomics: large-scale phytochemistry in the functional genomics era. Phytochem. 62 (6), 817-836 (2003).
- Bottcher, C., von Roepenack-Lahaye, E., Willscher, E., Scheel, D., Clemens, S. Evaluation of matrix effects in metabolite profiling based on capillary liquid chromatography electrospray ionization quadrupole time-of-flight mass spectrometry. Anal Chem. 79 (4), 1507-1513 (2007).
- Toffali, K., et al. Novel aspects of grape berry ripening and post-harvest withering revealed by untargeted LC-ESI-MS metabolomics analysis. Metabolomics. 7 (3), 424-436 (2011).
- Martin, J. C., et al. Can we trust untargeted metabolomics? Results of the metabo-ring initiative, a large-scale, multi-instrument inter-laboratory study. Metabolomics. 11 (4), 807-821 (2015).
- Jaillon, O., et al. The grapevine genome sequence suggests ancestral hexaploidization in major angiosperm phyla. Nature. 449 (7161), 463-467 (2007).
- Velasco, R., et al. A high quality draft consensus sequence of the genome of a heterozygous grapevine variety. Plos One. 2 (12), (2007).
- Tornielli, G. B., Zamboni, A., Zenoni, S., Delledonne, M., Pezzotti, M., Gerós, H., Chaves, M., Delrot, S. Ch. 11. The Biochemestry of the Grape Berry. 11, (2012).
- Anesi, A., et al. Towards a scientific interpretation of the terroir concept: plasticity of the grape berry metabolome. BMC Plant Biol. 15, 1-17 (2015).
- Berdeja, M., et al. Water limitation and rootstock genotype interact to alter grape berry metabolism through transcriptome reprogramming. Hort Res. 2, 1-13 (2015).
- Carbonell-Bejerano, P., et al. Solar ultraviolet radiation is necessary to enhance grapevine fruit ripening transcriptional and phenolic responses. BMC Plant Biol. 14, 1-16 (2014).
- Carbonell-Bejerano, P., et al. Reducing sampling bias in molecular studies of grapevine fruit ripening: transcriptomic assessment of the density sorting method. Theor Exp Plant Phys. 28 (1), 109-129 (2016).
- Carbonell-Bejerano, P., et al. Circadian oscillatory transcriptional programs in grapevine ripening fruits. BMC Plant Biol. 14, 1-15 (2014).
- Cavallini, E., et al. Functional diversification of grapevine MYB5a and MYB5b in the control of flavonoid biosynthesis in a petunia anthocyanin regulatory mutant. Plant & Cell Physiol. 55 (3), 517-534 (2014).
- Cramer, G. R., et al. Transcriptomic analysis of the late stages of grapevine (Vitis vinifera cv. Cabernet Sauvignon) berry ripening reveals significant induction of ethylene signaling and flavor pathways in the skin. BMC Plant Biol. 14, 1-21 (2014).
- Dal Santo, S., et al. The plasticity of the grapevine berry transcriptome. Genome Biol. 14 (6), 1-17 (2013).
- Fasoli, M., et al. The Grapevine Expression Atlas Reveals a Deep Transcriptome Shift Driving the Entire Plant into a Maturation Program. Plant Cell. 24 (9), 3489-3505 (2012).
- Gambino, G., et al. Co-evolution between Grapevine rupestris stem pitting-associated virus and Vitis vinifera L. leads to decreased defence responses and increased transcription of genes related to photosynthesis. J Exp Bot. 63 (16), 5919-5933 (2012).
- Ghan, R., et al. Five omic technologies are concordant in differentiating the biochemical characteristics of the berries of five grapevine (Vitis vinifera L.) cultivars. BMC Genomics. 16 (1), 1-26 (2015).
- Pastore, C., et al. Selective defoliation affects plant growth, fruit transcriptional ripening program and flavonoid metabolism in grapevine. BMC Plant Biol. 13, 1-13 (2013).
- Pastore, C., et al. Increasing the source/sink ratio in Vitis vinifera (cv Sangiovese) induces extensive transcriptome reprogramming and modifies berry ripening. BMC Genomics. 12, 1-23 (2011).
- Rinaldo, A. R., et al. A Grapevine Anthocyanin Acyltransferase, Transcriptionally Regulated by VvMYBA, Can Produce Most Acylated Anthocyanins Present in Grape Skins. Plant Physiol. 169 (3), 1897-1916 (2015).
- Royo, C., et al. Developmental, transcriptome, and genetic alterations associated with parthenocarpy in the grapevine seedless somatic variant Corinto bianco. J Exp Bot. , 259-273 (2015).
- Venturini, L., et al. De novo transcriptome characterization of Vitis vinifera cv. Corvina unveils varietal diversity. BMC Genomics. 14, 1-13 (2013).
- Commisso, M., Strazzer, P., Toffali, K., Stocchero, M., Guzzo, F. Untargeted metabolomics: an emerging approach to determine the composition of herbal products. Comput Struct Biotechnol J. 4, 1-7 (2013).
- Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Oresic, M. MZmine 2: Modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data. BMC Bioinformatics. 11, 1-11 (2010).
- Ashburner, M., et al. Gene Ontology: tool for the unification of biology. Nat Genet. 25 (1), 25-29 (2000).
