El concepto Terroir interpretada a través de baya de la uva metabolómica y transcriptómica
Summary
En este artículo se describe la aplicación de la metabolómica no focalizados, transcriptómica y análisis estadístico multivariado para transcripciones de bayas de uva y metabolitos con el fin de profundizar en el concepto de terroir, es decir, el impacto del medio ambiente sobre los rasgos de calidad de las bayas.
Abstract
Terroir se refiere a la combinación de factores ambientales que afectan a las características de los cultivos como la vid (Vitis vinifera) de acuerdo con hábitats particulares y prácticas de gestión. Este artículo muestra cómo ciertas firmas de terroir se pueden detectar en el metaboloma de bayas y transcriptoma de la Corvina vid cv utilizando el análisis estadístico multivariado. El método requiere en primer lugar un plan de muestreo apropiado. En este caso de estudio, se seleccionó un clon específico del cultivar Corvina para minimizar las diferencias genéticas, y las muestras se obtuvieron de siete viñedos que representan las tres macro zonas diferentes durante tres temporadas de cultivo diferentes. Un enfoque metabolómica LC-MS no directo se recomienda debido a su alta sensibilidad, acompañado de procesamiento de datos eficiente utilizando software MZmine y una estrategia de identificación de metabolitos basado en análisis de árbol de fragmentación. Análisis completo transcriptoma se puede lograr utilizando microarrayssondas que contienen cubriendo ~ 99% de todos los genes de vid predichos, lo que permite el análisis simultáneo de todos los genes expresados diferencialmente en el contexto de diferentes terroirs. Por último, el análisis de datos multivariados basado en métodos de proyección se puede usar para superar el efecto fuerte-vendimia específica, permitiendo que los metabolómica y datos transcriptómica a integrarse y se analizaron en detalle para identificar correlaciones informativos.
Introduction
análisis de datos a gran escala basado en los genomas, proteomas y transcriptomes, metabolomes de plantas ofrece una visión sin precedentes en el comportamiento de los sistemas complejos, tales como las características de terroir del vino, que reflejan las interacciones entre plantas de vid y su entorno. Debido a que el terroir de un vino puede ser distinto, incluso cuando los clones de vid idénticas se cultivan en diferentes viñedos, el análisis de la genómica es de poca utilidad debido a que los genomas clonados son idénticos. En cambio, es necesario tener en cuenta las correlaciones entre la expresión génica y las propiedades metabólicas de las bayas, que determinan las características de calidad de vino. El análisis de la expresión génica a nivel de los beneficios del transcriptoma de las propiedades químicas similares de todas las transcripciones, lo que facilita el análisis cuantitativo mediante la explotación de características universales tales como la hibridación con sondas inmovilizadas en microarrays. En contraste, los métodos analíticos universales en la proteómica unand metabolómica son más difíciles debido a la enorme diversidad física y química de las proteínas y los metabolitos individuales. En el caso de la metabolómica esta diversidad es aún más extrema porque metabolitos individuales difieren enormemente en tamaño, polaridad, la abundancia y la volatilidad, así que no hay proceso de extracción simple o método de análisis ofrece un enfoque holístico.
Entre las plataformas de análisis adecuado para metabolitos no volátiles, los basados en cromatografía líquida de alto rendimiento acoplada a espectrometría de masas (HPLC-MS) son mucho más sensibles que otras alternativas tales como HPLC con rayos ultravioletas o de diodos detectores de matriz (HPLC-UV, HPLC-DAD ) o espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN), pero el análisis cuantitativo por HPLC-MS puede ser influenciada por fenómenos tales como el efecto de la matriz y la supresión de iones / mejora 1-3. La investigación de tales efectos durante el análisis de bayas de uva Corvina por HPLC-MS usando una fuente de ionización por electropulverización (HPLC-ESI-MS), mostró que los azúcares y otras moléculas con los tiempos más bajos de retención fueron fuertemente subregistro, probablemente también refleja el gran número de moléculas en esta zona, y que la abundancia de otras moléculas se puede subestimar, sobrestimado o no afectado por el efecto de la matriz , pero la normalización de datos para el efecto de la matriz parecía tener un impacto limitado en el resultado global de 4,5. El método descrito en este documento se optimiza para el análisis de metabolitos a medio de polaridad que se acumulan en altos niveles en las bayas de uva durante la maduración, y que se ven afectados significativamente por el terroir. Ellos incluyen antocianinas, flavonoles, flavan-3-oles, procianidinas, otros flavonoides, resveratrol, estilbenos, ácido hidroxicinámico y ácidos hidroxibenzoico, que en conjunto determinan el color, el sabor y las propiedades relacionadas con la salud de los vinos. Otros metabolitos, tales como azúcares y ácidos orgánicos alifáticos, son ignorados debido a la cuantificación por HPLC-MS es poco fiable debido a la matriz efect y la supresión de iones fenómenos 5. Dentro de la gama de polaridad seleccionado por este método, el enfoque es no directo en que tiene por objeto detectar como muchos metabolitos diferentes como sea posible 6.
Transcriptómica métodos que permiten a miles de transcripciones de vid para controlar de forma simultánea se ven facilitadas por la disponibilidad de la secuencia completa del genoma de la vid 7,8. métodos transcriptómica temprana basada en la secuencia de ADNc de alto rendimiento se han desarrollado con el advenimiento de la secuenciación de próxima generación en una colección de procedimientos que se describen colectivamente como tecnología de RNA-Seq. Este enfoque se está convirtiendo rápidamente en el método de elección para estudios de transcriptómica. Sin embargo, una gran cantidad de literatura sobre la base de microarray, que permiten a miles de transcripciones para ser cuantificados en paralelo por la hibridación, se ha acumulado para la vid. De hecho, antes de RNA-Seq se convirtió en una tecnología dominante, muchas plataformas de microarrays comerciales dedicados habían sidodesarrollado permitiendo transcriptoma de la vid a inspeccionar con gran detalle. Entre la gran variedad de plataformas, sólo dos, efectuar análisis de transcriptoma en todo el genoma 9. La matriz más evolucionado permitió la hibridación de hasta 12 muestras independientes en un solo dispositivo, lo que reduce los costes de cada experimento. Los 12 sub-series compuestas cada 135.000 sondas 60-mer que representan 29.549 transcripciones de vid. Este dispositivo ha sido utilizado en un gran número de estudios 10-24. Estas dos plataformas se han interrumpido, sino una nueva costumbre de microarrays se ha diseñado recientemente y representa un desarrollo más reciente, ya que contiene un número aún mayor de las sondas que representan los genes recién descubiertos vid adicionales 25.
Los conjuntos de datos de gran venta producidas por la transcriptómica y metabolómica análisis requieren métodos estadísticos adecuados para el análisis de datos, incluyendo las técnicas multivariantes para determinar las correlaciones entre la forma diferentes de datos. Las técnicas multivariantes más utilizados son los basados en la proyección, y estos pueden ser sin supervisión, tales como el análisis de componentes principales (PCA), o supervisado, como la proyección ortogonal bidireccional a las estructuras latentes análisis discriminante (O2PLS-DA) 26. El protocolo presentado en este artículo utiliza PCA para el análisis exploratorio de datos y O2PLS-DA para identificar las diferencias entre los grupos de muestras.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este artículo describe las metabolómica, transcriptómica y protocolos de análisis estadísticos utilizados para interpretar el concepto de terroir baya de la uva. análisis metabolómica por HPLC-ESI-MS es lo suficientemente sensible para detectar un gran número de metabolitos al mismo tiempo, pero la cuantificación relativa se ve afectada por el efecto de la matriz y de iones de supresión / mejora. Sin embargo, un enfoque similar ya se ha utilizado para describir el proceso de maduración y fulminante post-cosec…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work benefited from the networking activities coordinated within the EU-funded COST ACTION FA1106 “An integrated systems approach to determine the developmental mechanisms controlling fleshy fruit quality in tomato and grapevine”. This work was supported by the ‘Completamento del Centro di Genomica Funzionale Vegetale’ project funded by the CARIVERONA Bank Foundation and by the ‘Valorizzazione dei Principali Vitigni Autoctoni Italiani e dei loro Terroir (Vigneto)’ project funded by the Italian Ministry of Agricultural and Forestry Policies. SDS was financed by the Italian Ministry of University and Research FIRB RBFR13GHC5 project “The Epigenomic Plasticity of Grapevine in Genotype per Environment Interactions”.
Materials
| Mill Grinder | IKA | IKA A11 basic | |
| HPLC Autosampler | Beckman Coulter | - | System Gold 508 Autosampler |
| HPLC System | Beckman Coulter | - | System Gold 127 Solvent Module HPLC |
| C18 Guard Column | Grace | - | Alltima HP C18 (7.5×2.1mm; 5μm) Guard Column |
| C18 Column | Grace | - | Alltima HP C18 (150×2.1mm; 3μm) Column |
| Mass Spectometer | Bruker Daltonics | - | Bruker Esquire 6000; The mass spectometer was equipped with an ESI source and the analyzer was an ion trap. |
| Extraction solvents and HPLC buffers | Sigma | 34966 | Methanol LC-MS grade |
| Sigma | 94318 | Formic acid LC-MS grade | |
| Sigma | 34967 | Acetonitrile LC-MS grade | |
| Sigma | 39253 | Water LC-MS grade | |
| Minisart RC 4 Syringe filters (0.2 μm) | Sartorius | 17764 | |
| Softwares for data collection (a) and processing (b) | Bruker Daltonics | – | Bruker Daltonics Esquire 5.2 Control (a); Esquire 3.2 Data Analysis and MzMine 2.2 softwares (b) |
| Spectrum Plant Total RNA kit | Sigma-Aldrich | STRN250-1KT | For total RNA extractino from grape pericarps |
| Nanodrop 1000 | Thermo Scientific | 1000 | |
| BioAnalyzer 2100 | Agilent Technologies | G2939A | |
| RNA 6000 Nano Reagents | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
| RNA Chips | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
| Agilent Gene Expression Wash Buffer 1 | Agilent Technologies | 5188-5325 | |
| Agilent Gene Expression Wash Buffer 2 | Agilent Technologies | 5188-5326 | |
| LowInput QuickAmp Labeling kit One-Color | Agilent Technologies | 5190-2305 | |
| Kit RNA Spike In – One-Color | Agilent Technologies | 5188-5282 | |
| Gene Expression Hybridization Kit | Agilent Technologies | 5188-5242 | |
| RNeasy Mini Kit (50) | Qiagen | 74104 | For cRNA Purification |
| Agilent SurePrint HD 4X44K 60-mer Microarray | Agilent Technologies | G2514F-048771 | |
| eArray | Agilent Technologies | – | https://earray.chem.agilent.com/earray/ |
| Gasket slides | Agilent Technologies | G2534-60012 | Enable Agilent SurePrint Microarray 4-array Hybridization |
| Thermostatic bath | Julabo | – | |
| Hybridization Chamber | Agilent Technologies | G2534-60001 | |
| Microarray Hybridization Oven | Agilent Technologies | G2545A | |
| Hybridization Oven Rotator Rack | Agilent Technologies | G2530-60029 | |
| Rotator Rack Conversion Rod | Agilent Technologies | G2530-60030 | |
| Staining kit | Bio-Optica | 10-2000 | Slide-staining dish and Slide rack |
| Magnetic stirrer device | AREX Heating Magnetic Stirrer | F20540163 | |
| Thermostatic Oven | Thermo Scientific | Heraeus – 6030 | |
| Agilent Microarray Scanner | Agilent Technologies | G2565CA | |
| Scanner Carousel, 48-position | Agilent Technologies | G2505-60502 | |
| Slide Holders | Agilent Technologies | G2505-60525 | |
| Feature extraction software v11.5 | Agilent Technologies | – | inside the Agilent Microarray Scanner G2565CA |
| SIMCA + V13 Software | Umetrics |
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