Den Terroir Concept Fortolket gennem Grape Berry Metabolomics og Transcriptomics
Summary
Denne artikel beskriver anvendelsen af ikke-målrettede metabolomics, transcriptomics og multivariat statistisk analyse til drue bær udskrifter og metabolitter for at få indsigt i terroir koncept, dvs. virkningen af miljøet på bær kvalitet træk.
Abstract
Terroir refererer til kombinationen af miljømæssige faktorer, der påvirker karakteristika afgrøder såsom Grapevine (Vitis vinifera) i henhold til særlige levesteder og ledelsespraksis. Denne artikel viser, hvordan visse terroir signaturer kan påvises i bær metabolomet og transkriptom af vinavlsprodukter kultivar Corvina hjælp multivariat statistisk analyse. Metoden kræver først en passende stikprøveplan. I dette casestudie blev en specifik klon af Corvina sorten valgte at minimere genetiske forskelle, og prøver blev indsamlet fra syv vinmarker, der repræsenterer tre forskellige makro-zoner i løbet af tre forskellige vækstsæsoner. Det anbefales ikke-målrettede LC-MS metabolomics tilgang på grund af sin høje følsomhed, ledsaget af effektiv databehandling under anvendelse MZmine software og en metabolit identifikation strategi baseret på fragmentering træ analyse. Omfattende transkriptom analyse kan opnås ved anvendelse microarraysindeholdende prober dækker ~ 99% af alle forudsagte grapevine gener, tillade samtidig analyse af alle differentielt udtrykte gener i forbindelse med forskellige terroirs. Endelig kan anvendes multivariate data analyse baseret på projektion metoder til at overvinde den stærke årgang-specifik virkning, og metabolomics og transcriptomics data, der skal integreres og analyseret i detaljer for at identificere informative korrelationer.
Introduction
Storstilet dataanalyse baseret på genomer, transcriptomes, proteomer og metabolomes af planter giver en hidtil uset indsigt i adfærd af komplekse systemer, såsom terroir karakteristika vin, der afspejler samspillet mellem grapevine planter og deres omgivelser. Fordi terroir af en vin kan være selvstændig, selv når identiske vinavlsprodukter kloner dyrkes i forskellige vinmarker, genomforskning analyse er til megen nytte, fordi klonede genomer er identiske. er stedet er det nødvendigt at se på sammenhænge mellem genekspression og de metaboliske egenskaber af de bær, der bestemmer kvaliteten træk af vin. Analysen af genekspression på niveau med transkriptomet fordelene ved de tilsvarende kemiske egenskaber for alle transkripter, hvilket letter kvantitativ analyse ved at udnytte universelle egenskaber såsom hybridisering til immobiliserede prober på microarrays. I modsætning hertil universelle analytiske metoder i proteomics ennd metabolomics er mere udfordrende på grund af den enorme fysiske og kemiske diversitet individuelle proteiner og metabolitter. I tilfælde af metabolomics denne mangfoldighed er endnu mere ekstrem, fordi de enkelte metabolitter varierer voldsomt i størrelse, polaritet, overflod og volatilitet, så ingen enkelt udvinding proces eller analysemetode tilbyder en holistisk tilgang.
Blandt de analytiske platforme er egnede til ikke-flygtige metabolitter, der er baseret på højtryksvæskekromatografi koblet til massespektrometri (HPLC-MS) er langt mere følsomme end alternativer såsom HPLC med ultraviolet eller diode array detektorer (HPLC-UV, HPLC-DAD ) eller kernemagnetisk resonans (NMR) spektroskopi, men kvantitativ analyse ved HPLC-MS kan påvirkes af fænomener som matrix effekt og ion suppression / enhancement 1-3. Undersøgelsen af sådanne virkninger under analysen af Corvina vindruer ved HPLC-MS ved anvendelse af en elektrospray-ioniseringskilde (HPLC-ESI-MS), viste, at sukkere og andre molekyler med de laveste retentionstider var stærkt underrapporteret, sandsynligvis også afspejler det store antal molekyler i denne zone, og at den overflod af andre molekyler kan undervurderes, utilstrækkeligt eller upåvirket af matrixeffekten , men de data, normalisering for matrix effekt syntes at have begrænset indvirkning på den overordnede resultater 4,5. Den her beskrevne metode er optimeret til analyse af mellemlange polaritet metabolitter, der ophobes ved høje niveauer i drue bær under modningen, og som i væsentlig grad påvirket af terroir. De omfatter anthocyaniner, flavonoler, flavan-3-oler, procyanidiner, andre flavonoider, resveratrol, stilbener, hydroxycinnamic syrer og hydroxybenzoesyre syrer, der tilsammen bestemmer farve, smag og sundhedsmæssige egenskaber af vine. Andre metabolitter, såsom sukkerarter og alifatiske organiske syrer, ignoreres, fordi kvantificering ved HPLC-MS er upålidelige på grund matricen effekt og ion suppression fænomener 5. Inden polariteten område udvalgt af denne metode, tilgangen er irrelevante, da den har til formål at opdage så mange forskellige metabolitter som muligt 6.
Transcriptomics metoder, der tillader tusinder af vinavlsprodukter udskrifter skal overvåges samtidig lettes ved tilgængeligheden af komplette vinstok genom sekvens 7,8. Tidlige transcriptomics metoder baseret på high-throughput cDNA sekventering har udviklet sig med fremkomsten af næste generations sekventering til en samling af procedurer kollektivt beskrevet som RNA-Seq teknologi. Denne fremgangsmåde bliver hurtigt den foretrukne metode til transcriptomics studier. Men en stor mængde litteratur baseret på microarray, der tillader tusinder af udskrifter skal kvantificeres parallelt af hybridisering, har oparbejdet til vinstok. Faktisk før RNA-Seq blev en mainstream teknologi, havde mange dedikerede kommercielle microarray platforme væretudviklet så vinstok transkriptom skal inspiceres i stor detalje. Blandt de mange forskellige platforme, kun to tilladt genom-dækkende transkriptom analyse 9. Den mest udviklede vifte tillod hybridisering af op til 12 uafhængige stikprøver på en enkelt enhed og dermed reducere omkostningerne ved hvert forsøg. De 12 sub-arrays hver omfattede 135.000 60-mer sonder repræsenterer 29,549 vinavlsprodukter udskrifter. Denne enhed har været anvendt i en lang række undersøgelser 10-24. Disse to platforme er nu indstillet, men en ny brugerdefineret microarray er for nylig blevet designet og repræsenterer en nyere udvikling, da det indeholder et endnu større antal sonder, der repræsenterer yderligere nyopdagede vinavlsprodukter gener 25.
De store sale datasæt produceret af transcriptomics og metabolomics analyser kræver egnede statistiske metoder til analyse af data, herunder multivariate teknikker til at bestemme sammenhænge mellem anden forms af data. De mest anvendte multivariate teknikker er dem baseret på fremskrivning, og disse kan være uden opsyn, såsom principal komponent analyse (PCA), eller overvåget, såsom tovejs retvinklede projektion til latente strukturer diskriminant analyse (O2PLS-DA) 26. Protokollen præsenteres i denne artikel benytter PCA til analyse sonderende data og O2PLS-DA til at identificere forskelle mellem grupper af prøver.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne artikel beskriver de metabolomics, transcriptomics og analyse protokoller statistiske bruges til at fortolke den drue bær terroir koncept. Metabolomics analyse ved HPLC-ESI-MS er følsom nok til at detektere et stort antal metabolitter samtidigt, men relativ kvantificering påvirkes af matrixeffekten og ion suppression / ekstraudstyr. Imidlertid har en lignende fremgangsmåde allerede blevet brugt til at beskrive modning og efter høst tilintetgørende af Corvina bær, og korrektionen af matrix effekter haft en b…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work benefited from the networking activities coordinated within the EU-funded COST ACTION FA1106 “An integrated systems approach to determine the developmental mechanisms controlling fleshy fruit quality in tomato and grapevine”. This work was supported by the ‘Completamento del Centro di Genomica Funzionale Vegetale’ project funded by the CARIVERONA Bank Foundation and by the ‘Valorizzazione dei Principali Vitigni Autoctoni Italiani e dei loro Terroir (Vigneto)’ project funded by the Italian Ministry of Agricultural and Forestry Policies. SDS was financed by the Italian Ministry of University and Research FIRB RBFR13GHC5 project “The Epigenomic Plasticity of Grapevine in Genotype per Environment Interactions”.
Materials
| Mill Grinder | IKA | IKA A11 basic | |
| HPLC Autosampler | Beckman Coulter | - | System Gold 508 Autosampler |
| HPLC System | Beckman Coulter | - | System Gold 127 Solvent Module HPLC |
| C18 Guard Column | Grace | - | Alltima HP C18 (7.5×2.1mm; 5μm) Guard Column |
| C18 Column | Grace | - | Alltima HP C18 (150×2.1mm; 3μm) Column |
| Mass Spectometer | Bruker Daltonics | - | Bruker Esquire 6000; The mass spectometer was equipped with an ESI source and the analyzer was an ion trap. |
| Extraction solvents and HPLC buffers | Sigma | 34966 | Methanol LC-MS grade |
| Sigma | 94318 | Formic acid LC-MS grade | |
| Sigma | 34967 | Acetonitrile LC-MS grade | |
| Sigma | 39253 | Water LC-MS grade | |
| Minisart RC 4 Syringe filters (0.2 μm) | Sartorius | 17764 | |
| Softwares for data collection (a) and processing (b) | Bruker Daltonics | – | Bruker Daltonics Esquire 5.2 Control (a); Esquire 3.2 Data Analysis and MzMine 2.2 softwares (b) |
| Spectrum Plant Total RNA kit | Sigma-Aldrich | STRN250-1KT | For total RNA extractino from grape pericarps |
| Nanodrop 1000 | Thermo Scientific | 1000 | |
| BioAnalyzer 2100 | Agilent Technologies | G2939A | |
| RNA 6000 Nano Reagents | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
| RNA Chips | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
| Agilent Gene Expression Wash Buffer 1 | Agilent Technologies | 5188-5325 | |
| Agilent Gene Expression Wash Buffer 2 | Agilent Technologies | 5188-5326 | |
| LowInput QuickAmp Labeling kit One-Color | Agilent Technologies | 5190-2305 | |
| Kit RNA Spike In – One-Color | Agilent Technologies | 5188-5282 | |
| Gene Expression Hybridization Kit | Agilent Technologies | 5188-5242 | |
| RNeasy Mini Kit (50) | Qiagen | 74104 | For cRNA Purification |
| Agilent SurePrint HD 4X44K 60-mer Microarray | Agilent Technologies | G2514F-048771 | |
| eArray | Agilent Technologies | – | https://earray.chem.agilent.com/earray/ |
| Gasket slides | Agilent Technologies | G2534-60012 | Enable Agilent SurePrint Microarray 4-array Hybridization |
| Thermostatic bath | Julabo | – | |
| Hybridization Chamber | Agilent Technologies | G2534-60001 | |
| Microarray Hybridization Oven | Agilent Technologies | G2545A | |
| Hybridization Oven Rotator Rack | Agilent Technologies | G2530-60029 | |
| Rotator Rack Conversion Rod | Agilent Technologies | G2530-60030 | |
| Staining kit | Bio-Optica | 10-2000 | Slide-staining dish and Slide rack |
| Magnetic stirrer device | AREX Heating Magnetic Stirrer | F20540163 | |
| Thermostatic Oven | Thermo Scientific | Heraeus – 6030 | |
| Agilent Microarray Scanner | Agilent Technologies | G2565CA | |
| Scanner Carousel, 48-position | Agilent Technologies | G2505-60502 | |
| Slide Holders | Agilent Technologies | G2505-60525 | |
| Feature extraction software v11.5 | Agilent Technologies | – | inside the Agilent Microarray Scanner G2565CA |
| SIMCA + V13 Software | Umetrics |
References
- Jessome, L. L., Volmer, D. A. Ion suppression: A major concern in mass spectrometry. Lc Gc N Am. 24 (5), 498-510 (2006).
- Kim, H. K., Choi, Y. H., Verpoorte, R. NMR-based plant metabolomics: where do we stand, where do we go?. Trends Biotech. 29 (6), 267-275 (2011).
- Sumner, L. W., Mendes, P., Dixon, R. A. Plant metabolomics: large-scale phytochemistry in the functional genomics era. Phytochem. 62 (6), 817-836 (2003).
- Bottcher, C., von Roepenack-Lahaye, E., Willscher, E., Scheel, D., Clemens, S. Evaluation of matrix effects in metabolite profiling based on capillary liquid chromatography electrospray ionization quadrupole time-of-flight mass spectrometry. Anal Chem. 79 (4), 1507-1513 (2007).
- Toffali, K., et al. Novel aspects of grape berry ripening and post-harvest withering revealed by untargeted LC-ESI-MS metabolomics analysis. Metabolomics. 7 (3), 424-436 (2011).
- Martin, J. C., et al. Can we trust untargeted metabolomics? Results of the metabo-ring initiative, a large-scale, multi-instrument inter-laboratory study. Metabolomics. 11 (4), 807-821 (2015).
- Jaillon, O., et al. The grapevine genome sequence suggests ancestral hexaploidization in major angiosperm phyla. Nature. 449 (7161), 463-467 (2007).
- Velasco, R., et al. A high quality draft consensus sequence of the genome of a heterozygous grapevine variety. Plos One. 2 (12), (2007).
- Tornielli, G. B., Zamboni, A., Zenoni, S., Delledonne, M., Pezzotti, M., Gerós, H., Chaves, M., Delrot, S. Ch. 11. The Biochemestry of the Grape Berry. 11, (2012).
- Anesi, A., et al. Towards a scientific interpretation of the terroir concept: plasticity of the grape berry metabolome. BMC Plant Biol. 15, 1-17 (2015).
- Berdeja, M., et al. Water limitation and rootstock genotype interact to alter grape berry metabolism through transcriptome reprogramming. Hort Res. 2, 1-13 (2015).
- Carbonell-Bejerano, P., et al. Solar ultraviolet radiation is necessary to enhance grapevine fruit ripening transcriptional and phenolic responses. BMC Plant Biol. 14, 1-16 (2014).
- Carbonell-Bejerano, P., et al. Reducing sampling bias in molecular studies of grapevine fruit ripening: transcriptomic assessment of the density sorting method. Theor Exp Plant Phys. 28 (1), 109-129 (2016).
- Carbonell-Bejerano, P., et al. Circadian oscillatory transcriptional programs in grapevine ripening fruits. BMC Plant Biol. 14, 1-15 (2014).
- Cavallini, E., et al. Functional diversification of grapevine MYB5a and MYB5b in the control of flavonoid biosynthesis in a petunia anthocyanin regulatory mutant. Plant & Cell Physiol. 55 (3), 517-534 (2014).
- Cramer, G. R., et al. Transcriptomic analysis of the late stages of grapevine (Vitis vinifera cv. Cabernet Sauvignon) berry ripening reveals significant induction of ethylene signaling and flavor pathways in the skin. BMC Plant Biol. 14, 1-21 (2014).
- Dal Santo, S., et al. The plasticity of the grapevine berry transcriptome. Genome Biol. 14 (6), 1-17 (2013).
- Fasoli, M., et al. The Grapevine Expression Atlas Reveals a Deep Transcriptome Shift Driving the Entire Plant into a Maturation Program. Plant Cell. 24 (9), 3489-3505 (2012).
- Gambino, G., et al. Co-evolution between Grapevine rupestris stem pitting-associated virus and Vitis vinifera L. leads to decreased defence responses and increased transcription of genes related to photosynthesis. J Exp Bot. 63 (16), 5919-5933 (2012).
- Ghan, R., et al. Five omic technologies are concordant in differentiating the biochemical characteristics of the berries of five grapevine (Vitis vinifera L.) cultivars. BMC Genomics. 16 (1), 1-26 (2015).
- Pastore, C., et al. Selective defoliation affects plant growth, fruit transcriptional ripening program and flavonoid metabolism in grapevine. BMC Plant Biol. 13, 1-13 (2013).
- Pastore, C., et al. Increasing the source/sink ratio in Vitis vinifera (cv Sangiovese) induces extensive transcriptome reprogramming and modifies berry ripening. BMC Genomics. 12, 1-23 (2011).
- Rinaldo, A. R., et al. A Grapevine Anthocyanin Acyltransferase, Transcriptionally Regulated by VvMYBA, Can Produce Most Acylated Anthocyanins Present in Grape Skins. Plant Physiol. 169 (3), 1897-1916 (2015).
- Royo, C., et al. Developmental, transcriptome, and genetic alterations associated with parthenocarpy in the grapevine seedless somatic variant Corinto bianco. J Exp Bot. , 259-273 (2015).
- Venturini, L., et al. De novo transcriptome characterization of Vitis vinifera cv. Corvina unveils varietal diversity. BMC Genomics. 14, 1-13 (2013).
- Commisso, M., Strazzer, P., Toffali, K., Stocchero, M., Guzzo, F. Untargeted metabolomics: an emerging approach to determine the composition of herbal products. Comput Struct Biotechnol J. 4, 1-7 (2013).
- Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Oresic, M. MZmine 2: Modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data. BMC Bioinformatics. 11, 1-11 (2010).
- Ashburner, M., et al. Gene Ontology: tool for the unification of biology. Nat Genet. 25 (1), 25-29 (2000).
