קונספט טרואר לפרש דרך הענבים הברים Metabolomics ו transcriptomics
Summary
מאמר זה מתאר את היישום של metabolomics לא ממוקד, transcriptomics ניתוח סטטיסטי רב משתני תמלילי ברי ענבים מטבוליטים כדי לקבל תובנה לגבי מושג טרואר, כלומר, השפעת הסביבה על תכונות איכות ברה.
Abstract
טרואר מתייחס שילוב של גורמים סביבתיים המשפיעים על המאפיינים של גידולים כמו גפן (גפן יין) על פי בתי גידול מסוימים ודרכי ניהולו. מאמר זה מראה כיצד חתימות טרואר מסוימות ניתן לאתר את metabolome גרגרי היער transcriptome של מוסר ים זן גפן באמצעות ניתוח סטטיסטי רב משתנה. השיטה הראשונה דורשת תוכנית הדגימה המתאימה. במחקר במקרה זה, שיבוט מסוים של זן קורבינה נבחר כדי למזער הבדלים גנטיים, דגימות נאספו משבעה כרמים המייצגים שלושה אזורי מאקרו שונים במהלך שלוש עונות גידול שונות. גישת metabolomics ממוקדת LC-MS מומלץ בשל הרגישות הגבוהה שלו, מלווה עיבוד נתונים יעיל באמצעות תוכנת MZmine ואסטרטגית זיהוי המטבוליט סמך ניתוח עץ פיצול. ניתן להשיג ניתוח transcriptome מקיף באמצעות מערכיםבדיקות המכילות כיסוי ~ 99% מכלל גני גפן החזה, המאפשר ניתוח סימולטני של כל הגנים לידי הביטוי באופן דיפרנציאלי בהקשר של terroirs השונה. לבסוף, ניתוח נתונים רבים משתנים המבוסס על שיטות הקרנה ניתן להשתמש כדי להתגבר על ההשפעה וינטאג ספציפי החזקה, המאפשר metabolomics ונתוני transcriptomics להיות משולבים ונותחו בהרחבה לזהות מתאמים אינפורמטיבי.
Introduction
ניתוח נתונים בקנה מידה גדולה מבוססים על הגנום, transcriptomes, proteomes ו metabolomes של צמחים מספק תובנה חסרת תקדים אל תוך ההתנהגות של מערכות מורכבות, כגון מאפייני טרואר יין המשקפים את יחסי הגומלין בין צמחי גפן לבין סביבתם. מכיוון טרואר של יין יכול להיות ברור גם כאשר שיבוטי גפן זהים גדלים בכרמים שונים, ניתוח הגנומיקה הוא שימוש קצת כי הגנום המשובט זהה. במקום יש צורך להסתכל מתאמים בין ביטוי גנים המאפיינים המטבולי של פירות יער, אשר קובעות את תכונות איכות היין. ניתוח ביטוי גנים ברמת יתרונות transcriptome מן התכונות הכימיות הדומות של כל התמלילים, המאפשרות ניתוח כמוני על ידי ניצול מאפיינים אוניברסאליים כמו הכלאת בדיקות משותקות על microarrays. לעומת זאת, שיטות אנליטיות אוניברסלית בתוך פרוטאומיקהnd metabolomics יותר מאתגר בגלל המגוון הפיסיקלי וכימי הענק של חלבונים מטבוליטים פרט. במקרה של metabolomics המגוון הזה הוא עוד יותר קיצוני כי מטבוליטים הפרט להיות שונה בהרבה בגודלם, קוטביות, שפע ותנודתיות, ולכן אין תהליך החילוץ יחיד או שיטה אנליטית מציע גישה הוליסטית.
בין פלטפורמות אנליטית מתאימות מטבוליטים בלתי נדיף, אלה המבוססים על כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים מצמידים ספקטרומטריית מסה (HPLC-MS) הם הרבה יותר רגיש מאשר חלופות כגון HPLC עם גלאי מערך אולטרא סגולים או דיודה (HPLC-UV, HPLC-DAD ספקטרוסקופיה) או תהודה מגנטית גרעינית (NMR), אבל ניתוח כמותי על ידי HPLC-MS יכול להיות מושפע תופעות כגון אפקט מטריקס ודיכוי יון / שיפור 1-3. חקירת תופעות כאלה במהלך הניתוח של פרותי יער ענבי קורבינה ידי HPLC-MS באמצעות מקור יינון electrospray (HPLC-ESI-MS), הראה כי סוכרים ומולקולות אחרות עם פעמי השמירה הנמוכות ביותר היו underreported מאוד, כנראה גם המשקפים את המספר הגדול של מולקולות באזור זה, וכי השפע של מולקולות אחרות יכול לזלזל, בהערכה או מושפע השפעת מטריקס נורמליזציה, אך הנתונים להשפעת מטריקס נראה שתהיה לה השפעה מוגבלת על 4,5 התוצאות הכוללות. השיטה המתוארת במסמך זה הוא אופטימיזציה עבור הניתוח של מטבוליטים בינוני-קוטבי שמצטברים ברמות גבוהות פרותי יער ענבים במהלך הבשלה, ואשר השפיעו באופן משמעותי על ידי טרואר. הם כוללים אנתוציאנינים, flavonols, flavan-3-ols, procyanidins, פלבנואידים אחרים, רזברטרול, stilbenes, חומצות hydroxycinnamic וחומצות hydroxybenzoic, אשר יחד לקבוע את צבע, טעם ומאפיינים הקשורים לבריאות של יינות. מטבוליטים אחרים, כגון סוכרים וחומצות אורגניות אליפטיות, הם התעלמו בגלל quantitation ידי HPLC-MS הוא אמין בשל מטריקס effect ודיכוי יון תופעות 5. בטווח הקוטבי שנבחר על ידי שיטה זו, הגישה היא לא ממוקדת בכך שהיא שואפת לזהות כמה מטבוליטים שונים כמו 6 אפשריים.
שיטות transcriptomics המאפשרים אלף תמלילי גפן להיות במעקב בו זמנית הם הקלו על ידי הזמינות של רצף הגנום גפן המלאה 7,8. שיטות transcriptomics מוקדם על סמך רצף cDNA תפוקה גבוהה התפתחו עם כניסתו של רצף הדור הבא לתוך אוסף של הליכים המתוארים קולקטיבי טכנולוגיית RNA-seq. גישה זו הופכת במהירות את שיטת הבחירה של מחקרי transcriptomics. עם זאת, גוף גדול של ספרות המבוססת על microarray, המאפשר אלף תמלילים כדי לכמת במקביל על ידי כלאה, צבר עבור גפן. ואכן, לפני RNA-seq הפך טכנולוגיה המיינסטרים, פלטפורמות microarray מסחריות ייעודיות רבות היוtranscriptome גפן פתח המאפשר להיבדק בפירוט רב. בין המגוון של פלטפורמות המכריעים, רק שתיים להותיר ניתוח transcriptome הגנום כולו 9. המערך המפותח ביותר אפשר ההכלאה של עד 12 דגימות עצמאיות על מכשיר אחד, ובכך להקטין את העלויות של כל ניסוי. 12 תת-המערכים כל מורכבת 135,000 בדיקות 60-mer מייצג 29,549 תמלילי גפן. מכשיר זה נעשה שימוש במספר רב של מחקרים 10-24. פלטפורמות אלה שתי עכשיו כבר הופסקו אלא microarray מנהג חדש תוכנן לאחרונה ומייצגות התפתחות מאוחר יותר מכיוון שהיא מכילה מספר גדול יותר של בדיקות המייצגים גני גפן שהתגלו לאחרונה נוספים 25.
בבסיסי הנתונים גדול למכירה המיוצרים על ידי ניתוח transcriptomics ו metabolomics דורשים שיטות סטטיסטיות מתאימות לניתוח נתונים, כוללים טכניקות מרובות משתנות כדי לקבוע מתאמים בין צורה שונהים של נתונים. הטכניקות רבות המשתנה הנפוץ ביותר הן אלה המבוססים על הקרנה, ואלה יכולים להיות ללא השגחה, כגון ניתוח מרכיבים ראשי (PCA), או בפיקוח, כגון היטל אורתוגונלי דו-כיוונית למבנים סמויים ניתוח מבחין (O2PLS-DA) 26. הפרוטוקול המובא במאמר זה מנצל PCA לניתוח נתונים גישוש O2PLS-DA לזהות הבדלים בין קבוצות של דגימות.
Protocol
Representative Results
Discussion
מאמר זה מתאר את metabolomics, transcriptomics ופרוטוקולים ניתוח סטטיסטי המשמש לפרש את המושג טרואר ברי ענבים. ניתוח Metabolomics ידי HPLC-ESI-MS הוא רגיש מספיק כדי לזהות מספר רב של מטבוליטים זמנית, אבל quantitation ביחס מושפע השפעה מטריקס ודיכוי / שיפור יון. עם זאת, גישה דומה כבר נעשה שימוש כדי לתאר א…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work benefited from the networking activities coordinated within the EU-funded COST ACTION FA1106 “An integrated systems approach to determine the developmental mechanisms controlling fleshy fruit quality in tomato and grapevine”. This work was supported by the ‘Completamento del Centro di Genomica Funzionale Vegetale’ project funded by the CARIVERONA Bank Foundation and by the ‘Valorizzazione dei Principali Vitigni Autoctoni Italiani e dei loro Terroir (Vigneto)’ project funded by the Italian Ministry of Agricultural and Forestry Policies. SDS was financed by the Italian Ministry of University and Research FIRB RBFR13GHC5 project “The Epigenomic Plasticity of Grapevine in Genotype per Environment Interactions”.
Materials
| Mill Grinder | IKA | IKA A11 basic | |
| HPLC Autosampler | Beckman Coulter | - | System Gold 508 Autosampler |
| HPLC System | Beckman Coulter | - | System Gold 127 Solvent Module HPLC |
| C18 Guard Column | Grace | - | Alltima HP C18 (7.5×2.1mm; 5μm) Guard Column |
| C18 Column | Grace | - | Alltima HP C18 (150×2.1mm; 3μm) Column |
| Mass Spectometer | Bruker Daltonics | - | Bruker Esquire 6000; The mass spectometer was equipped with an ESI source and the analyzer was an ion trap. |
| Extraction solvents and HPLC buffers | Sigma | 34966 | Methanol LC-MS grade |
| Sigma | 94318 | Formic acid LC-MS grade | |
| Sigma | 34967 | Acetonitrile LC-MS grade | |
| Sigma | 39253 | Water LC-MS grade | |
| Minisart RC 4 Syringe filters (0.2 μm) | Sartorius | 17764 | |
| Softwares for data collection (a) and processing (b) | Bruker Daltonics | – | Bruker Daltonics Esquire 5.2 Control (a); Esquire 3.2 Data Analysis and MzMine 2.2 softwares (b) |
| Spectrum Plant Total RNA kit | Sigma-Aldrich | STRN250-1KT | For total RNA extractino from grape pericarps |
| Nanodrop 1000 | Thermo Scientific | 1000 | |
| BioAnalyzer 2100 | Agilent Technologies | G2939A | |
| RNA 6000 Nano Reagents | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
| RNA Chips | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
| Agilent Gene Expression Wash Buffer 1 | Agilent Technologies | 5188-5325 | |
| Agilent Gene Expression Wash Buffer 2 | Agilent Technologies | 5188-5326 | |
| LowInput QuickAmp Labeling kit One-Color | Agilent Technologies | 5190-2305 | |
| Kit RNA Spike In – One-Color | Agilent Technologies | 5188-5282 | |
| Gene Expression Hybridization Kit | Agilent Technologies | 5188-5242 | |
| RNeasy Mini Kit (50) | Qiagen | 74104 | For cRNA Purification |
| Agilent SurePrint HD 4X44K 60-mer Microarray | Agilent Technologies | G2514F-048771 | |
| eArray | Agilent Technologies | – | https://earray.chem.agilent.com/earray/ |
| Gasket slides | Agilent Technologies | G2534-60012 | Enable Agilent SurePrint Microarray 4-array Hybridization |
| Thermostatic bath | Julabo | – | |
| Hybridization Chamber | Agilent Technologies | G2534-60001 | |
| Microarray Hybridization Oven | Agilent Technologies | G2545A | |
| Hybridization Oven Rotator Rack | Agilent Technologies | G2530-60029 | |
| Rotator Rack Conversion Rod | Agilent Technologies | G2530-60030 | |
| Staining kit | Bio-Optica | 10-2000 | Slide-staining dish and Slide rack |
| Magnetic stirrer device | AREX Heating Magnetic Stirrer | F20540163 | |
| Thermostatic Oven | Thermo Scientific | Heraeus – 6030 | |
| Agilent Microarray Scanner | Agilent Technologies | G2565CA | |
| Scanner Carousel, 48-position | Agilent Technologies | G2505-60502 | |
| Slide Holders | Agilent Technologies | G2505-60525 | |
| Feature extraction software v11.5 | Agilent Technologies | – | inside the Agilent Microarray Scanner G2565CA |
| SIMCA + V13 Software | Umetrics |
References
- Jessome, L. L., Volmer, D. A. Ion suppression: A major concern in mass spectrometry. Lc Gc N Am. 24 (5), 498-510 (2006).
- Kim, H. K., Choi, Y. H., Verpoorte, R. NMR-based plant metabolomics: where do we stand, where do we go?. Trends Biotech. 29 (6), 267-275 (2011).
- Sumner, L. W., Mendes, P., Dixon, R. A. Plant metabolomics: large-scale phytochemistry in the functional genomics era. Phytochem. 62 (6), 817-836 (2003).
- Bottcher, C., von Roepenack-Lahaye, E., Willscher, E., Scheel, D., Clemens, S. Evaluation of matrix effects in metabolite profiling based on capillary liquid chromatography electrospray ionization quadrupole time-of-flight mass spectrometry. Anal Chem. 79 (4), 1507-1513 (2007).
- Toffali, K., et al. Novel aspects of grape berry ripening and post-harvest withering revealed by untargeted LC-ESI-MS metabolomics analysis. Metabolomics. 7 (3), 424-436 (2011).
- Martin, J. C., et al. Can we trust untargeted metabolomics? Results of the metabo-ring initiative, a large-scale, multi-instrument inter-laboratory study. Metabolomics. 11 (4), 807-821 (2015).
- Jaillon, O., et al. The grapevine genome sequence suggests ancestral hexaploidization in major angiosperm phyla. Nature. 449 (7161), 463-467 (2007).
- Velasco, R., et al. A high quality draft consensus sequence of the genome of a heterozygous grapevine variety. Plos One. 2 (12), (2007).
- Tornielli, G. B., Zamboni, A., Zenoni, S., Delledonne, M., Pezzotti, M., Gerós, H., Chaves, M., Delrot, S. Ch. 11. The Biochemestry of the Grape Berry. 11, (2012).
- Anesi, A., et al. Towards a scientific interpretation of the terroir concept: plasticity of the grape berry metabolome. BMC Plant Biol. 15, 1-17 (2015).
- Berdeja, M., et al. Water limitation and rootstock genotype interact to alter grape berry metabolism through transcriptome reprogramming. Hort Res. 2, 1-13 (2015).
- Carbonell-Bejerano, P., et al. Solar ultraviolet radiation is necessary to enhance grapevine fruit ripening transcriptional and phenolic responses. BMC Plant Biol. 14, 1-16 (2014).
- Carbonell-Bejerano, P., et al. Reducing sampling bias in molecular studies of grapevine fruit ripening: transcriptomic assessment of the density sorting method. Theor Exp Plant Phys. 28 (1), 109-129 (2016).
- Carbonell-Bejerano, P., et al. Circadian oscillatory transcriptional programs in grapevine ripening fruits. BMC Plant Biol. 14, 1-15 (2014).
- Cavallini, E., et al. Functional diversification of grapevine MYB5a and MYB5b in the control of flavonoid biosynthesis in a petunia anthocyanin regulatory mutant. Plant & Cell Physiol. 55 (3), 517-534 (2014).
- Cramer, G. R., et al. Transcriptomic analysis of the late stages of grapevine (Vitis vinifera cv. Cabernet Sauvignon) berry ripening reveals significant induction of ethylene signaling and flavor pathways in the skin. BMC Plant Biol. 14, 1-21 (2014).
- Dal Santo, S., et al. The plasticity of the grapevine berry transcriptome. Genome Biol. 14 (6), 1-17 (2013).
- Fasoli, M., et al. The Grapevine Expression Atlas Reveals a Deep Transcriptome Shift Driving the Entire Plant into a Maturation Program. Plant Cell. 24 (9), 3489-3505 (2012).
- Gambino, G., et al. Co-evolution between Grapevine rupestris stem pitting-associated virus and Vitis vinifera L. leads to decreased defence responses and increased transcription of genes related to photosynthesis. J Exp Bot. 63 (16), 5919-5933 (2012).
- Ghan, R., et al. Five omic technologies are concordant in differentiating the biochemical characteristics of the berries of five grapevine (Vitis vinifera L.) cultivars. BMC Genomics. 16 (1), 1-26 (2015).
- Pastore, C., et al. Selective defoliation affects plant growth, fruit transcriptional ripening program and flavonoid metabolism in grapevine. BMC Plant Biol. 13, 1-13 (2013).
- Pastore, C., et al. Increasing the source/sink ratio in Vitis vinifera (cv Sangiovese) induces extensive transcriptome reprogramming and modifies berry ripening. BMC Genomics. 12, 1-23 (2011).
- Rinaldo, A. R., et al. A Grapevine Anthocyanin Acyltransferase, Transcriptionally Regulated by VvMYBA, Can Produce Most Acylated Anthocyanins Present in Grape Skins. Plant Physiol. 169 (3), 1897-1916 (2015).
- Royo, C., et al. Developmental, transcriptome, and genetic alterations associated with parthenocarpy in the grapevine seedless somatic variant Corinto bianco. J Exp Bot. , 259-273 (2015).
- Venturini, L., et al. De novo transcriptome characterization of Vitis vinifera cv. Corvina unveils varietal diversity. BMC Genomics. 14, 1-13 (2013).
- Commisso, M., Strazzer, P., Toffali, K., Stocchero, M., Guzzo, F. Untargeted metabolomics: an emerging approach to determine the composition of herbal products. Comput Struct Biotechnol J. 4, 1-7 (2013).
- Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Oresic, M. MZmine 2: Modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data. BMC Bioinformatics. 11, 1-11 (2010).
- Ashburner, M., et al. Gene Ontology: tool for the unification of biology. Nat Genet. 25 (1), 25-29 (2000).
