eine Speichel- Antikörper Multiplex-Immunoassay Entwicklung der Humanexposition Umwelt Pathogens zu messen
Summary
In the current climate of scarce resources, new technologies are emerging that allow researchers to conduct studies cheaper, faster and with more precision. Here we describe the development of a bead-based salivary antibody multiplex immunoassay to measure human exposure to multiple environmental pathogens simultaneously.
Abstract
Die Ätiologie und die Auswirkungen der Exposition des Menschen gegenüber Umwelt Erreger sind von großer Besorgnis weltweit und damit die Fähigkeit, Belichtung und Infektionen mit kostengünstige, High-Throughput-Ansätze unabdingbar wäre zu beurteilen. Diese Handschrift beschreibt die Entwicklung und Analyse eines bead-based multiplex Immunoassay Lage sind, die Anwesenheit von Antikörpern in menschlichen Speichel an mehrere Pathogene gleichzeitig messen. Saliva ist besonders attraktiv in dieser Anwendung, da sie nicht invasiv ist, billiger und leichter zu erfassen als Serum. Antigene aus Umweltpathogene wurden an carboxylierte Mikrokügelchen (Perlen) und verwendet, um Antikörper in sehr kleinen Volumina von menschlichen Speichelproben zu messen, eine Perlenbasis, Lösungsphasen-Assay. Die Perlen wurden in Verbindung mit Antigenen von Campylobacter jejuni, Helicobacter pylori, Toxoplasma gondii, Noroviren (G I.1 und G II.4) und Hepatitis – A – Virus. Um sicherzustellen, dass die Antigene wurden ausreichend gekoppeltdie Perlen, Kupplung wurde mit biotinyliertem Anti-Spezies Sekundär Nachweis-Antikörper und Streptavidin-R-Phycoerythrin Reporter (SAPE) unter Verwendung von artspezifischen, von Tieren stammenden primären Fänger-Antikörper, gefolgt von einer Inkubation bestätigt. Als Kontrolle nicht-spezifische Bindung zu messen, wurde ein Beadset identisch zu den anderen behandelt, außer es nicht an Antigen gekoppelt wurde. Die antigen-gekoppelt und Kontrollkügelchen wurden dann mit prospektiv gesammelten menschlichen Speichelproben inkubiert, auf einem Hochdurchsatz-Analysator auf den Prinzipien Durchflusszytometrie basierend gemessen von und die Anwesenheit von Antikörpern gegen jedes Antigen wurde in mittlere Fluoreszenzintensitätseinheiten (MFI), gemessen . Dieser Multiplex-Immunoassay hat eine Reihe von Vorteilen, mehr Daten mit weniger Probe enthält; reduzierte Kosten und Arbeit; und die Fähigkeit, den Test zu viele Ziele von Interesse anzupassen. Die Ergebnisse zeigen, dass die Speichel Multiplex-Immunoassay-fähig sein kann vorherigen Belichtungen und Infektionen zu identifizieren, die especia sein kannlly nützlich in Beobachtungsstudien großen menschlichen Populationen beteiligt sind.
Introduction
Eighty-acht Prozent der weltweiten Durchfall-Erkrankungen mit der Exposition des Menschen gegenüber kontaminierten Wasser, unsichere Lebensmittel und schlechte Hygiene / Hygiene verbunden ist, etwa 1,5 Millionen Menschen ums Leben kamen, die meisten davon sind 1 Kinder. Dies ist ein wichtiger Grund zur Besorgnis für Beamte des öffentlichen Gesundheitswesens und politische Entscheidungsträger. In dem Bemühen , mit wässrigen und anderen Umweltkrankheitserreger assoziiert Belichtungen und Krankheiten zu untersuchen, haben wir eine Multiplex – Immunoassay Antikörper in menschlichen Proben 2-4 zu messen. Dieses Verfahren kann auf epidemiologische Studien angewendet werden, die Exposition des Menschen auf diese Erreger zu bestimmen und zu einer besseren immunoprevalence und Incident-Infektionen zu definieren.
Saliva hält erhebliche Versprechen als Alternative für den menschlichen Biomarker-Forschung im Serum. Zu den Vorteilen der Verwendung von Speichel sind die Nicht-Invasivität und einfache Probenentnahme, niedrige Kosten, und die Proben leicht von Kindern 5-7 gesammelt werden kann </ Sup>. Serum und Speichelproben wurden ausgiebig für Antikörper gegen H. studierte pylori 2,3,8, Plasmodium falciparum 9, Entamoeba histolytica 10, parvum Cryptosporidium 3,11, Streptococcus pneumoniae 12, Hepatitis – Viren A und C 13-14, Noroviren 2-4,15, T. gondii 2-4, Dengue – Virus 16, human immunodeficiency virus (HIV) 17 und Escherichia coli O157: H7 18.
Ein Multiplex-Immunoassays ermöglicht die Analyse von mehreren Analyten gleichzeitig in einem einzigen Probenvolumen und innerhalb eines einzelnen Zyklus oder laufen. Multiplexed Antigene von C. jejuni, T. gondii, H. pylori, Hepatitis – A – Virus und zwei Noroviren wurden verwendet , um menschliche Speichel IgG 2-4 und IgA 3,4 und Plasma – IgG 2,3 Antikörper – Antworten auf diese Erreger zu messen unter Verwendung einesMultiplexen Immunoassay bead-basiert. Wenn sie in Verbindung mit epidemiologischen Studien der Exposition gegenüber Mikroben in Wasser, Boden und Nahrungsmittel verwendet wird, kann die Art des Assay in dieser Studie beschriebenen wertvolle Informationen liefern, das Verständnis von Infektionen durch Pathogene verursacht Umwelt zu verbessern. Außerdem Speichel Antikörper Daten aus solchen Untersuchungen erhalten wird, kann verwendet werden , um die Risikobewertung Modelle 19-22 verbessern.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diese Ergebnisse zeigen, dass die Multiplex-Immunoassay-Verfahren ist nützlich zum Unterscheiden zwischen Speichelproben, die immunopositive oder immunonegative sind. Um zu bestimmen, immunopositivity wurde durch Berechnung der Mittelwert plus drei Standardabweichungen der log transformierten MFI Reaktionen der Steuerung abgekoppelt Perlen eine einzige Grenzpunkt mit all den Speichelproben getestet entwickelt. Der Cut-off-Punkt die Fähigkeit zur Beurteilung der Belichtung und immunoprevalence entweder eine einzelne od…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Clarissa Curioso was supported through an appointment to the Research Participation Program at the U.S. Environmental Protection Agency administered by the Oak Ridge Institute for Science and Education through an interagency agreement between the U.S. Department of Energy and U.S. EPA.
Materials
| Equipment and Software | |||
| Microcentrifuge | Thermo Electron Corporation | 75002446 | Used to centrifuge samples |
| Vortex Mixer | VWR | G560 | Used to mix samples |
| Sonicator (mini) | Fisher Scientific | 15-337-22 | Used to separate beads |
| Pipettors P10, P20, P100, P1000, 8 ch. | Capp | Various | |
| Hemacytometer (Bright Line) | Housser Scientific | 3200 | Used to count coupled beads |
| Multiscreen Vacuum Manifold | Millipore | MSVMHTS00 | Used in washing steps to remove supernatant |
| MicroShaker | VWR | 12620-926 | Used to agitate beads during incubations |
| Tube rack (1.5mL and 0.5mL) (assorted) | VWR | 30128-346 | |
| Weighing Scale | Mettler or other | Used to measure wash reagents for making buffers | |
| Dynabead Sample Mixer | Invitrogen | 947-01 | Used during coupling incubation step |
| MatLab (R2014b) | The MathWorks, Inc. | Used to analyze antibody response data | |
| Microsoft Excel 2014 | Microsoft Corporation | Used to analyze antibody response data | |
| Luminex Analyzer with xPonent 3.1 software | Luminex Corporation | LX200-XPON3.1 | Instrument and software used to run assay |
| Antigens | |||
| GI.1 Norwalk Virus : p-particle | Xi Jiang (CCHMC)* | NA | *Cincinnati Childrens' Hospital. Final conc. 5 µg. |
| GII.4 Norovirus VA387 : p-particle | Xi Jiang (CCHMC)* | NA | *Cincinnati Childrens' Hospital. Final conc. 5 µg. |
| Hepatitis A Virus : grade II concentrate from cell culture | Meridian Life Sciences | 8505 | Antigen coupled at 100 µg |
| Helicobacter pylori : lysate | Meridian Life Sciences | R14101 | Antigen coupled at 25 µg |
| Toxoplasma gondii : recombinant p30 (SAG1) | Meridian Life Sciences | R18426 | Antigen coupled at 25 µg |
| Campylobacter jejuni : heat killed whole cells | KPL | 50-92-93 | Antigen coupled at 50 µg |
| Primary Antibodies | |||
| Guinea pig anti-Norovirus | (CCHMC)* | NA | Used for coupling confirmation |
| Mouse anti-Hepatitis A IgG | Meridian Life Sciences | C65885M | Used for coupling confirmation |
| Mouse anti-Hepatitis A IgG | Meridian Life Sciences | C65885M | Used for coupling confirmation |
| BacTraceAffinity Purified Antibody to Helicobacter pylori | KPL | 01-93-94 | Used for coupling confirmation |
| Goat pAb to Toxoplasma gondii | Abcam | Ab23507 | Used for coupling confirmation |
| BacTrace Goat anti-Campylobacter species | KPL | 01-92-93 | Used for coupling confirmation |
| Secondary Antibodies | |||
| Biotin-SP-Conjugated AffiniPure Donkey anti-Goat IgG (H+L) | Jackson | 705-065-149 | Used for coupling confirmation |
| Biotinylated Rabbit anti-Goat IgG (H+L) | KPL | 16-13-06 | Used for coupling confirmation |
| Biotinylated Goat anti-Mouse IgG (H+L) | KPL | 16-18-06 | Used for coupling confirmation |
| Affinity Purified Antibody Biotin Labeled Goat anti-Rabbit IgG(H+L) | KPL | 176-1506 | Used for coupling confirmation |
| Affinity Purified Antibody Biotin Labeled Goat anti-Human IgG(ᵞ) | KPL | 16-10-02 | Used for Salivary Immunoassay |
| Consumables | |||
| 1.5 mL copolymer microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-2500 | Used as low binding microcentrifuge tubes |
| 10 µL pipette tip refills | BioVentures | 5030050C | |
| 200 µL pipette tip refills | BioVentures | 5030080C | |
| 1000 µL pipette tip refills | BioVentures | 5130140C | |
| Aluminum foil | Various Vendors | Used keep beads in the dark during incubations | |
| Deep Well plates | VWR | 40002-009 | Used for diluting saliva samples |
| Multiscreen Filter Plates | Millipore | MABVN1250 | Used to run assays |
| Oracol saliva collection system | Malvern Medical Developments Limited | Used for saliva collection | |
| Reagents | |||
| Carboxylated microspheres (beads) | Luminex Corporation | Dependent on bead set | Antigens are coupled to the microspheres |
| EDC (1-ethyl-3-[3dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride) | Pierce | 77149 or 22980 | Used in bead activation |
| Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) | Pierce | 24510 | Used in bead activation |
| Steptavidin-R-phycoerythrin (1mg/mL) | Molecular Probes | S-866 | Used as reporter |
| MES (2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid) | Sigma | M-2933 | Used for coupling |
| Tween-20 (Polyoxyethylenesorbitan monolaurate) | Sigma | P-9416 | Used in wash buffer to remove non-specific binding |
| Protein Buffers | |||
| PBS-TBN Blocking/ Storage Buffer (PBS, 0.1% BSA, 0.02% Tween-20, 0.05% Azide, pH 7.4)** | Filter Sterilize and store at 4°C | ||
| PBS, pH 7.4 | Sigma | P-3813 | 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl |
| BSA | Sigma | A-7888 | 0.1% (w/v) |
| Tween-20 | Sigma | P-9416 | 0.2% (v/v) |
| Sodium Azide (0.05% azide)** | Sigma | S-8032 | **Caution: Sodium azide is acutely toxic. Avoid contact with skin and eyes. Wear appropriate PPE's. Dispose of according to applicable laws. |
| MES/ Coupling Buffer (0.05 M MES, pH 5.0) | |||
| MES (2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid) | Sigma | S-3139 | |
| 5 N NaOH | Fisher | SS256-500 | |
| Assay Buffer (PBS, 1% BSA, pH 7.4) | Filter Sterilize and store at 4°C | ||
| PBS, 1% BSA, pH 7.4 | Sigma | P-3688 | 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1% BSA |
| Activation Buffer (0.1 M NaH2PO4, pH 6.2) | Filter Sterilize and store at 4°C | ||
| NaH2PO4 (Sodium phosphate, monobasic anhydrous) | Sigma | S-3139 | 0.1M NaH2PO4 |
| 5 N NaOH | Fisher | SS256-500 | |
| Wash Buffer (PBS, 0.05% Tween-20, pH 7.4) | Filter Sterilize and store at 4°C | ||
| PBS, 0.05% Tween-20, pH 7.4 | Sigma | P-3563 | 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 0.05% TWEEN |
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