Détermination des espèces et Quantification en mélanges utilisant la spectrométrie de masse MRM de Peptides appliquée à l'authentification de la viande

Summary

We present a protocol for identifying and quantifying the components in mixtures of species possessing similar proteins. Mass spectrometry detects peptides for identification, and gives relative quantitation by ratios of peak areas. As a tool food for fraud detection, the method can detect 1% horse in beef.

Abstract

We describe a simple protocol for identifying and quantifying the two components in binary mixtures of species possessing one or more similar proteins. Central to the method is the identification of ‘corresponding proteins’ in the species of interest, in other words proteins that are nominally the same but possess species-specific sequence differences. When subject to proteolysis, corresponding proteins will give rise to some peptides which are likewise similar but with species-specific variants. These are ‘corresponding peptides’. Species-specific peptides can be used as markers for species determination, while pairs of corresponding peptides permit relative quantitation of two species in a mixture. The peptides are detected using multiple reaction monitoring (MRM) mass spectrometry, a highly specific technique that enables peptide-based species determination even in complex systems. In addition, the ratio of MRM peak areas deriving from corresponding peptides supports relative quantitation. Since corresponding proteins and peptides will, in the main, behave similarly in both processing and in experimental extraction and sample preparation, the relative quantitation should remain comparatively robust. In addition, this approach does not need the standards and calibrations required by absolute quantitation methods. The protocol is described in the context of red meats, which have convenient corresponding proteins in the form of their respective myoglobins. This application is relevant to food fraud detection: the method can detect 1% weight for weight of horse meat in beef. The corresponding protein, corresponding peptide (CPCP) relative quantitation using MRM peak area ratios gives good estimates of the weight for weight composition of a horse plus beef mixture.

Introduction

The European horse meat scandal of 2013, in which undeclared horse meat was found in a number of supermarket beef products¹, highlights the need for testing methods capable of detecting and measuring food fraud in meat. Several technologies have been explored, especially enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and DNA-based methods². An alternative route, based on mass spectrometry, targets species-specific peptides which in turn arise from species-specific proteins. Here we outline one such peptide-based approach that offers both identification and relative quantitation of the adulterant species in a meat mixture³.

The protocol is framed in the context of red meats and the desire to determine the presence of one in another at the level of 1% by weight, the level considered by some to represent fraudulent food adulteration as opposed to contamination⁴. The method relies in the first instance on identifying a protein which is nominally ‘the same’ in all target meats. Myoglobin, the protein responsible for the red color of meat, is a good candidate since it is abundant, relatively heat tolerant and water soluble, and has been used for species determination of meat previously^5,6. The myoglobins for beef (Bos Taurus), pork (Sus scrofa), horse (Equus caballus) and lamb (Ovis aries)³, for instance, are nominally the same, as required, but their sequences are not identical. Such groups of ‘similar but different’ proteins, like these four myoglobins, can conveniently be described as ‘corresponding proteins’. The sequence differences in these four myoglobins are species-specific: for example, the full myoglobin proteins for beef and horse, P02192 and P68082 respectively, each comprise 154 amino acids with 18 sequence differences between the two. Subject to proteolysis using trypsin these proteins produce two sets of peptides, some of which are identical, and some which show one or more species-specific amino acid differences: corresponding proteins therefore give rise to corresponding peptides.

The CPCP approach, therefore, seeks first to identify proteins from two or more species where these proteins exhibit limited species-specific sequence variants. These are corresponding proteins. Following proteolysis, corresponding proteins give rise to peptides, some of which likewise display species-specific sequence variants inherited from the parent protein. These are corresponding peptides. The CPCP approach can be used to compare levels of two corresponding proteins in a mixed species sample by monitoring the levels of corresponding peptides.

The natural technology for the detection of known peptides is multiple reaction monitoring mass spectrometry, or MRM-MS⁷. Species-specific peptides yield precursor ions, which along with their mass spectrometry fragment ions, are easily itemized in advance by software tools. These lists are then used to instruct the mass spectrometer to record only specific precursor plus fragment ion pairs, called transitions. A particular target peptide is therefore identified not only by its retention time in the chromatography preceding the mass spectrometer, but also by a set of transitions sharing a common precursor ion. This is a highly selective means of detecting known peptides that makes efficient use of the mass spectrometer resource.

Other authors have used mass spectrometry to test for meat adulteration via peptide markers but from disparate proteins^8-14. Using the corresponding proteins, corresponding peptides (CPCP) scheme, however, means experimental conditions can be optimized, aiding identification of the species in the mixture from known species-specific transitions. In addition, corresponding proteins and peptides will generally behave similarly in the extraction, proteolysis and detection stages. Since transition peak areas are quantitative and reproducible, ratios of peak areas arising from pairs of corresponding peptides from different species provide a direct estimate of the relative quantities of two meats in a mixture. In contrast, more traditional quantitation routes exploit calibrations based on reference materials to establish absolute quantitation^14,15.

Though the protocol is outlined in the context of myoglobin and meat, proteins other than myoglobin could be used for identification and relative quantitation via the CPCP strategy in meat mixtures, though potentially with modifications to the protocol. In addition the strategy is also applicable to binary mixtures of other species sharing one or more corresponding proteins.

The starting point for the protocol is purified ‘reference’ myoglobin, which for some species can be purchased but which for others must be prepared by conventional size-exclusion chromatography. The procedure for preparing reference myoglobin is not included in the protocol, but is described elsewhere³. Software tools¹⁶ are used to list candidate peptides and transitions arising from myoglobins of interest. Each reference myoglobin is subjected to proteolysis and the resultant peptides analyzed by liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS) to discover which of the candidate precursor ions and transitions are most useful, and to determine the matching peptide retention times. The outcome of this stage is a revised list of target peptides with their transitions, suitable for species determination, and a list of CPCP pairs, suitable for relative quantitation. To test real meats, sample extractions are prepared then subjected to proteolysis to generate peptides both from myoglobin and other extraneous proteins. The myoglobin-based peptides are then monitored by LC-ESI-MS/MS based on their listed transitions. The species present in a mixture are identified by the transition peaks associated with marker peptides. Estimates of the relative amounts of two meats in a binary mixture are calculated using ratios of transition peak areas. A set of test mixtures of pairs of meats will allow the ratio of peak areas for a given pair of transitions to be checked and calibrated against actual mixtures.

Protocol

1. protéolyse et analyse de myoglobine référence Protéolyse de la myoglobine de référence Préparer des solutions des myoglobine de référence purifiées (intervalle 0,2 à 0,5 mg / ml dans 25 mM de bicarbonate d' ammonium) 3. Transfert 1 ml aliquotes de chaque échantillon à 2 ml tubes de centrifugeuse. la dénaturation thermique des protéines extraites par chauffage de l'échantillon dans un bloc chauffant à 95 ° C pendant 30 min. Refroidir l'échantillon pendant environ 15 min jusqu'à ce qu'il atteigne la température ambiante. Ajouter 30 mg d'urée (concentration finale 0,5 M) pour améliorer la digestion, puis mélanger. protéolyse tryptique Préparer une solution à 1 mg / ml de trypsine dans 25 mM de bicarbonate d'ammonium et de stocker de la glace, au besoin. Ajouter un volume suffisant de trypsine de telle sorte que l'activité enzymatique finale est de 420 BAEE (benzoyl-L-arginine N – chlorhydrate de l' ester éthylique) unités / mg de protéine extraite, puis mélanger par tourbillonnement doux et laisser une nuit à 3 proteolyze7 ° C. Effectuer dodécylsulfate de sodium polyacrylamide sulfate électrophorèse sur gel (SDS-PAGE) 17 pour démontrer l'exhaustivité de la protéolyse. Dessalement de l'échantillon post-protéolyse Diluer l'échantillon 1: 2 v: v avec de l'eau. Activer un polymère à phase inverse (RP), la cartouche remplie d'un matériau RP 30 mg en ajoutant 1 ml de methanol, puis équilibrer la cartouche en ajoutant de l'acide formique à 1 ml de 1%. Chargez l'échantillon sur la cartouche par gravité. Laver avec 1 ml d'acide formique à 5% de méthanol / 1% par gravité. Eluer les peptides avec 1 ml d'acétonitrile / eau (90:10 v: v; acide formique à 0,1%) par gravité dans 2 ml microtubes préremplies avec 5 pi de diméthylsulfoxyde (DMSO). On élimine le solvant sous vide à 50 ° C en utilisant un évaporateur centrifuge pendant 120 minutes, puis on redissout le résidu dans 250 ul d'acétonitrile / eau (3:97 volume: volume, 0,1% d'acide formique). Transfertla solution à un faible volume du flacon auto-échantillonneur. Note: les échantillons peuvent être conservés à 4 ° C jusqu'au moment de liquide spectrométrie de masse par Chromatographie (LC / MS) analyse. Génération de listes de transition pour MRM Repérez les séquences de myoglobine pour les différentes viandes de la base de données UniProt. Entrez les séquences de myoglobine dans la case «cible» du logiciel de prédiction peptide et de transition (par exemple, Skyline). Si nécessaire, passez la souris sur un peptide de révéler sa liste de fragment. Cliquez sur «Paramètres» et sélectionnez «Peptide Settings». Entrez les préférences pour la digestion (ie, trypsine) et le nombre de clivages manqués (0). Valider la sélection requise pour d'autres paramètres, en particulier, la longueur du peptide (6-25), les exclusions N-terminaux (0) et pris en charge les modifications d'acides aminés (aucun). Cliquez sur "Paramètres" et sélectionnez "Paramètres de transition». Sélectionnez les préférences pourle type d'instrument utilisé pour l'analyse LC / MS. Cliquez sur "Exporter" et sélectionnez "Liste de transition» pour créer une feuille de calcul contenant les transitions et les paramètres de GRM générés. Analyse par LC / MS Mettre en place un système de gradient binaire (eau (A) et de l'acétonitrile (B), chacun avec 0,1% formique v d'acide: v) chromatographe liquide à haute performance (CLHP) avec échantillonneur automatique, colonne C18 core shell HPLC (10 cm x 2,1 mm , 2,6 um de taille de particules) connectée à un spectromètre de masse triple quadripolaire fonctionnant en mode électrospray positif avec détection de MRM. Dans le logiciel de collecte de données (par exemple, analyste), sélectionnez "Fichier" et "Nouveau" et cliquez sur «Méthode d' acquisition» dans la boîte de pop-up , puis cliquez sur 'OK'. Note: Ceci ouvre l'instrument éditeur de méthode, qui contient une liste des appareils connectés qui permettront la mise en place d'une nouvelle méthode / MS LC. Cliquez sur 'pompe binaire' et input la valeur de débit (300 pi / min) et les temps de gradient dans le tableau, établissant un profil de gradient binaire de 3% de B à 30% B plus de 22 min, augmentant à 100% de B à 23 min pour un 5 min lavent avant de revenir aux conditions initiales et rééquilibration pendant encore 6 min. Cliquez sur 'Autosampler' et insérez le volume d'injection (5 pi). Activer le «Needle Cycle de lavage» et entrer dans le «Wash Time» (30 sec) et sélectionnez «Port Flush». Cliquez sur 'Contrôleur de colonne thermostaté' et dans 'la colonne Four Properties' définir la «Température Gauche» et «Température droite» (40 ° C). Cliquez sur 'Mass Spectrometer »puis cliquez sur« Modifier les paramètres »pour entrer dans les conditions de gaz de source. Sélectionnez le «Type de numérisation» comme «MRM (MRM)» et le «Polarité» comme «positive». Aller à 'Résumé Période' et entrez le 'Durée Time', la durée totale de la LC analyse und équilibration (35 min). Dans le tableau clic droit et sélectionnez 'Declustering potentiel (DP) »et« Collision Energy (CP) "pour ajouter ces colonnes à la table. Entrez les Q1, Q3, Time (msec), ID, les valeurs DP et CE pour toutes les transitions, pour une seule espèce de viande, créé dans la liste de transition (voir étape 1.4.5). Note: Temps (ms) correspond à la durée de séjour, la durée du spectromètre de masse passe le balayage de chaque passage, la somme qui ne doit pas être supérieure à 3 secondes. Enregistrez le fichier Méthode d'acquisition (extension de fichier .dam). Remarque: Les étapes 1.5.2 – 1.5.8 doivent être répétées pour chaque espèce de viande. Cela va créer un fichier de méthode unique pour chaque espèce de viande en mode écran en préparation pour l'analyse ci-dessous. Dans le logiciel de collecte de données, cliquez sur «Acquire» et sélectionnez «Equilibrer». Dans la boîte qui apparaît, sélectionnez la méthode d'acquisition requise pour commencer l'équilibration de l'instrument. Mettez les flacons d'échantillon dans arack dans l'échantillonneur automatique. Cliquez sur "Fichier" et sélectionner "Nouveau" puis "Batch Acquisition». Dans l'onglet 'Sample' select 'Ajouter Set' puis 'Ajouter des échantillons ». Insérer le nombre d'échantillons à analyser et cliquez sur 'OK'. Dans la case "Acquisition", sélectionnez le fichier de la méthode qui sera utilisée pour l'analyse à partir du menu déroulant. Dans le tableau, sélectionnez «Code de la plaque» et sélectionnez la configuration du bac approprié dans le menu déroulant. Clic gauche dans la 'Plate code' en-tête de colonne, puis cliquez à droite et sélectionnez 'Fill Down'. Dans 'Position Vial' entrer dans la position de chaque échantillon dans l'échantillonneur automatique dans les lignes. Dans «Fichier de données 'entrer le nom du fichier pour l'acquisition, cliquez sur puis à gauche dans l'entête de la colonne suivie par un clic droit et sélectionnez' Fill Down '. Dans 'Sample Name' insérer l'identité de chacun des échantillons à analyser. Enregistrer en tant que fichier d'acquisition de lots (fichier extension .dab). Cliquez sur l'onglet «Soumettre» puis sélectionnez les échantillons qui doivent être analysés sur la LC / MS. Cliquez sur «Soumettre». Cliquez sur 'acquérir' et 'Start Sample "pour commencer l'analyse. Note: Chaque méthode d'acquisition numérise les transitions MRM sur toute la longueur du chromatographe pour une seule espèce de viande. paramètres du spectromètre de masse pour une acquisition MRM varient selon le type d'instrument et peptide. Voir les fichiers de données générés en utilisant un logiciel de visualisation de données. Cliquez sur XIC (ions extraits) et dans la liste déroulante en surbrillance tous les fragments (valeurs de Q3) pour un seul précurseur (Q1). Un nouveau volet ouvert qui montre que les transitions sélectionnées. Enregistrer le temps de rétention (R t) pour les groupes de transitions simultanées étant donné que ceux – ci correspondent à un seul peptide. Répétez les deux étapes précédentes pour chaque ensemble de transitions afin d'attribuer les pics à leurs peptides respectifs pour chaquedes espèces de viande. Notez les peptides marqueurs qui sont appropriés pour fournir l' identification des espèces (par exemple, peptide HPGDFGADAQGAMTK, précurseur m / z = 752, R t = 12,0 min, pour le cheval), ainsi que leurs temps de rétention, et notez qui forment des paires appropriées pour la quantification relative correspondant . Remarque: Par exemple, le peptide marqueur de cheval (précurseur m / z = 752) présente un peptide de boeuf correspondant HPSDFGADAQAAMSK (précurseur m / z = 767, Rt = 13,2 min). Afin de créer une méthode dynamique unique englobant toutes les espèces de viande, dans le logiciel de visualisation de données, pour chaque espèce de viande, à son tour, ouvrir les données de transition XIC pour chaque précurseur (attribué à un peptide particulier 1.5.8). Zoom sur le cluster de pointe au moment de rétention sélectionnée par un clic gauche et en faisant glisser le curseur sous le cluster. Identifier les transitions les plus intenses (par un clic droit sur l'étiquette de pointe). enregistrer manuellement les transitionset des temps de rétention dans une feuille de calcul. Pour entrer les paramètres comme une nouvelle méthode dynamique sur le logiciel / MS LC, cliquez sur «Mass Spectrometer» puis cliquez sur «Modifier les paramètres» pour entrer dans les conditions de gaz de source. Sélectionnez le «Type de numérisation» comme «MRM (MRM)» et le «Polarité» comme «positive». Aller à 'Résumé de la période "et entrez le temps de la durée (définie comme le temps total pour l'analyse LC et équilibration). Dans le tableau clic droit et sélectionnez 'Declustering potentiel (DP) »et« Collision Energy (CP) "pour ajouter ces colonnes à la table. Remarque: La colonne «Time» désigne maintenant le temps de rétention attendu (min) pour chaque transition. Dans la section "Modifier les paramètres de la / MS logiciel de collecte de données de LC, cochez la case« planifiée MRM ». Entrez le Q1, Q3, Temps (min), ID, les valeurs DP et CE pour les transitions créées dans la feuille de calcul (1.5.21) et enregistrez la méthode d'acquisition (file l'extension .dam). Remarque: Cette méthode réduit typiquement le nombre de transitions MRM à 4 la plus intense pour chaque peptide et numérise uniquement à travers la fenêtre de temps de rétention de chaque pic de peptide, ce qui donne une sensibilité améliorée et la qualité des données. Une méthode «dynamique» est une méthode «de rétention guidée temps fenêtrage», parfois appelé ordonnancement. 2. Préparation et analyse des échantillons d'étalonnage Extraction des mélanges à base de viande Utilisation de la viande préalablement congelé puis broyé en une poudre, préparer une gamme de mélanges de viande par pesée des quantités respectives de la viande (masse totale d'environ 300 mg) dans 15 ml tubes en plastique de centrifugeuse. Ajouter 4 ml de tampon d'extraction (0,15 M de chlorure de potassium + 0,15 M de tampon phosphate à pH 6,5). Vortex pendant 30 secondes. Extrait sur un agitateur de laboratoire à température ambiante pendant 2 h à 250 cycles / min. Note: Cycles / min se réfère à un mouvement oscillatoire. Transférer 2 ml deextrait dans un tube de microcentrifugeuse de 2 ml. Centrifuger pendant 5 min à 4 ° C à 17000 x g. Transfert 200 aliquotes du surnageant (réservant une petite quantité pour le dosage de la protéine, voir 2.2) dans 2 ml des tubes de centrifugeuse et sec en utilisant un évaporateur centrifuge (programme pré-établi: 50 ° C, sans ventilation et min durée 120). Dosage protéique Transfert 7 aliquotes du surnageant réservé (voir 2.1.4), en triple exemplaire dans les puits d'une plaque de 96 puits. Transfert 7 aliquotes d'une série d'étalons de protéine, en triple exemplaire, la gamme de 0 à 1,0 mg / ml de sérum-albumine bovine (SAB), dans la même plaque à 96 puits. Ajouter 200 ul de Coomassie ainsi que le dosage de protéines de réactif dans chaque puits. comparer visuellement la couleur des puits d'échantillons avec les normes de protéines pour vérifier les échantillons sont dans la gamme des normes d'étalonnage. Si nécessaire, répéter avec l'échantillon dilué de sorte qu'il devient à portée. Laissez la plaque à stet pendant 3 min. Éclater les bulles qui se sont formées avec une aiguille hypodermique. Analyser la plaque sur le lecteur de plaque en utilisant un protocole de point de terminaison standard à une longueur d'onde de 595 nm. Déterminer la concentration en protéines des échantillons en utilisant les données d'étalonnage des étalons protéiques. Note: Ceci est nécessaire pour le calcul de la quantité de trypsine utilisée dans la digestion par la trypsine. Protéolyse des mélanges à base de viande Redissoudre le résidu séché de l'étape 2.1.4 dans 1 ml de solution de bicarbonate d'ammonium 25 mM. Bien mélanger sur un rotamixer. Suivre le protocole de l'étape 1.1.3 à 1.3.7. Analyse par LC / MS Mettre en place la LC / MS comme précédemment (étape 1.5.1). Créer un nouveau lot d'acquisition comme indiqué précédemment (étapes 1.5.9 – 1.5.14), la sélection de la méthode d'acquisition créé à l'étape au 1.5.24 qui utilise une LC dynamique / méthode MS combinant toutes les espèces de viande, et d'acquérir les données pour les Digeséchantillons de viande ted. Afficher le chromatogramme complète dans le logiciel de visualisation de données. Afficher la XIC pour chaque transition fixé à son tour. Visuellement confirmer chaque cluster contient le nombre requis de pics en forme de cloche au temps de rétention prévu, confirmant ainsi l'existence du peptide sélectionné. Effectuer la quantification en utilisant les données de visualisation logiciel pour intégrer les zones de pointe pour chacune des transitions d'intérêt en double-cliquant sur 'Build Quantification Method »dans la barre de navigation. Dans le volet "Select Sample", sélectionnez le «Fichier de données» et «échantillon» à analyser pour générer une table 'analytes'. Cliquez sur l'onglet «Intégration» pour afficher la première des transitions (analytes) pour être intégré. Cliquez sur la boîte "Analyte" pour afficher la liste déroulante des transitions vers le bas. Sélectionnez chaque transition à son tour pour l'afficher et de confirmer visuellement le bon pic est sélectionné pour l'intégration. À Modifier ou forcer l'intégration, clic gauche et faites glisser le curseur sur le pic de cible (ce sera surligné en vert). Cliquez sur le bouton 'Select Peak' et cliquez sur «Appliquer». Enregistrer l'espace de travail sous forme de fichier de la méthode (de .qmf). Note: Ceci crée un fichier Quantification Méthode pour le calcul ultérieur des zones de pic de l'échantillon. Double cliquez sur «Quantification Assistant» dans la barre de navigation. Dans la fenêtre «Sélectionner des échantillons 'créer' Quantification Set 'en sélectionnant un seul« Fichier de données', puis un ou plusieurs «échantillons disponibles». Sélectionnez 'Next' pour afficher 'Sélectionnez Paramètres et requêtes "boîte. Laisser avec les valeurs par défaut, sélectionnez «Suivant» pour afficher «Sélectionner la méthode '. Dans le menu déroulant case «Méthode» sélectionner le fichier «Méthode d'intégration» créé à l'étape 2.4.8, puis sélectionnez «Terminer». Note: Ceci crée un «Tableau des résultats», y compris les surfaces des pics de transition liés à des mélanges à base de viande. <li> Save the 'Résultats Table' (extension de fichier .rdb), l'exportation sous forme de fichier texte (.txt) et l'ouvrir dans un tableur pour examiner les données. graphiques de tracé de pourcentage (par la transition zone de crête) d'une viande dans un autre par rapport au pourcentage mesuré (p / p) des deux viandes pour le MRM sélectionné pour les transitions sélectionnées à partir de peptides correspondant, en se concentrant sur les cas où les deux fragments contiennent le même nombre d'acides aminés comptés à partir de l'extrémité C-terminale. Remarque: fragments identiques avec des sites de fragmentation identiques donnent des résultats optimaux. Examiner les parcelles de 2.4.11 ci-dessus. Soit visuellement, ou en utilisant un outil de ligne de tendance dans le paquet de tracé, d'identifier un groupe de parcelles qui sont à la fois linéaire et de gradient similaire. Utiliser un ou plusieurs de ces CPCP ainsi que des combinaisons de fragments d'étalonnage dans les échantillons de viande réel. Note: Un graphique montrant un gradient inhabituel peut indiquer soit peptide ou la suppression de fragment avec une réduction conséquente du signal strength. parcelles non-linéaires peuvent indiquer la détection de crête pauvres ou d'autres problèmes. 3. Les échantillons de viande Extraction de protéines à partir d'échantillons de viande cible Le cas échéant, l'accise étrangère matériau non-viande de l'échantillon à l'aide d'une spatule. Par exemple, gratter la sauce et les pâtes d'une lasagne fraîche. Peser 20 g de la viande dans un récipient en métal. Ajouter 100 ml de 0,15 M de chlorure de potassium / tampon 0,15 M de potassium à un pH de 6,5 monophosphate. Extraire les protéines par mélange de la viande dans un homogénéisateur à grande vitesse pendant 1 min. Suivre le protocole de l'étape 2.1.4 – 2.3.2. L'analyse des échantillons par LC / MS Répétez l'étape 2.4.2 pour acquérir des données en utilisant la méthode de LC dynamique / MS. Identifier les peptides de chaque myoglobine de viande effectuée à l'étape 2.4.3. Pour la quantification, en utilisant le logiciel de quantification pour intégrer les aires des pics pour chaque transition d'intérêt,comme indiqué à l'étape 2.4.9. Pour l'identification des espèces dans un mélange, enregistrer ces peptides marqueurs répondant à des critères convenus pour le nombre de transitions et de signaler au bruit pour les transitions. Pour la quantification, utiliser des zones de transition de pointe intégrées, comme convenu à l'étape 2.4.12 et, en utilisant pourcentage en aire de transition de pointe, calculer le pourcentage de la myoglobine des deux espèces dans le mélange. Utiliser la connaissance préalable de la littérature 18 des niveaux de myoglobine probables dans la viande afin d' estimer les quantités relatives p / p de deux viandes présentes dans l'échantillon.

Representative Results

Dans une expérience unique de MRM dynamique en mode chaque transition programmé est enregistré séparément (comme nombre de détecteurs par seconde, cps) sur une fenêtre de temps de rétention spécifié. Par conséquent, à partir de toutes les données collectées dans une expérience, le pic d'intensité pour chaque transition peut être extrait individuellement. Ensuite, le seul signal est fini pour la fenêtre de temps de rétention fixé à cette transition. En dehors de la fenêtre, le signal est nulle par définition. Le signal pour une transition, par exemple, 752 → 1269 de cheval (peptide monoisotopique masse 1,501.66 daltons, précurseur d' ions m / z 751.84 daltons état ​​de charge = 2, un fragment d' ions y 13) a généralement pour concurrencer uniquement avec le bruit de mesure et non d'autres pics de transition qui pourrait peut-être d'autres espèces. La sortie est donc un ensemble de pics propres, un par transition, à un temps de rétention commun pour ces transitions partageant un ion précurseur commun. <p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1"> La figure 1 montre la sortie pour l'ensemble des quatre transitions 752 → (1269, 706, 248, 1366) pour un mélange de 1% p / p cheval dans la viande bovine. Depuis les quatre transitions affichées sont associées à cheval, et sont absents dans des échantillons de pur bœuf, d'agneau ou de porc, ces pics signifient la présence de cheval. Selon les critères de robustesse, un ensemble de deux ou plusieurs transitions dépassant chacun un certain signal spécifié au niveau de bruit établit l'identification. Ce chiffre établit donc la présence de cheval dans le mélange de 1% p / p cheval dans la viande bovine. Parfois, une seule transition isolée est détectée. Cela indique un match de chance d'ion précurseur et un seul fragment, peut-être à partir d'une protéine étrangère, avec ceux attendus du système et programmé dans le spectromètre de masse. Le caractère singulier de la crête, et sa présence à un temps de rétention inattendu, est le signature d'une transition accidentelle qui peut être ignoré. L'aire sous chaque pic de transition peut être calculée individuellement. À base d'un fragment approprié, le rapport du cheval dans les zones de pic de transition de la viande, par exemple, 752 → 1269 (cheval) à 767 → 1299 (bœuf), sera proportionnelle au rapport de la viande réelle dans le mélange. La figure 2 montre une parcelle de pourcentage en aire de pic pour ces deux transitions par rapport au poids en pourcentage du poids du cheval dans un mélange de cheval avec du boeuf. Si les zones de pic de transition de pourcentage correspondent au pourcentage de poids pour le poids de la viande, puis la pente est 1. La pente de cette parcelle est de 1,03, ce qui indique que, pour ces transitions et CPCP paire, les zones de transition de pointe donnent une mesure fiable des quantités relatives des deux viandes dans le mélange. Si la viande de cheval dans l'échantillon était deux fois plus riche que dans la myoglobine de la viande, puis, avec d'autres facteurs sans changement, la pente de la ligne serait supérieur à un. Figure 1. intensités MRM de transition en fonction du temps de rétention pour 1% p / p cheval dans la viande bovine. Les transitions sont 752 → (1269, 706, 248, 1366), en orange, noir, bleu et vert, respectivement. Le peptide marqueur est HPGDFGADAQGAMTK. Les quatre fragments de transition peuvent être noté y 13, y 7, y 2 et y 14 respectivement, où y n désigne le comptage en n acides aminés de l' extrémité C-terminale du peptide. Le signal au bruit varie de 23 à 53 au cours des quatre transitions. Une ligne rouge supplémentaire représente la transition 752 → 1269 pour 0% de cheval, 100% de boeuf à titre de comparaison. Seule la région non nulle de la durée de rétention est affiché. Ce chiffre a été modifié depuis Watson et al. 3.es / ftp_upload / 54420 / 54420fig1large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 2. Parcelle de cheval dans le bœuf, le poids pour cent pour le poids, par rapport à cheval dans le bœuf comme pour cent transition zone de pic. Le tracé utilise la paire de peptides de boeuf (767) et le cheval (752) et l'y 13 ion fragment pour les deux. Si A représente la surface du pic , puis l'ordonnée 100 A H / (A H + A B). La pente de la droite de meilleur ajustement (R 2 = 0,99) est de 1,03. Ce chiffre a été modifié depuis Watson et al. 3. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

La sélection d'une protéine cible appropriée est importante. Une bonne protéine cible a besoin d'avoir des formes correspondantes en espèces d'intérêt, la variation de séquence dépendant de l'espèce suffisante, la spécificité de l'espèce, et existent en quantités accessibles dans les organismes. Pour l'évaluation des mélanges qui ont subi un traitement (par exemple, le traitement thermique), une protéine ayant une séquence relativement insensible à ce que le traitement est souhaitable. Myoglobine est un bon candidat pour les viandes rouges, y compris les viandes rouges cuites, mais pas la seule possibilité. Une fois que la protéine cible est déterminée, la partie la plus critique du protocole est la protéolyse de la protéine. Une protéine différente de myoglobine peut bien exiger un protocole de protéolyse alternative.

Le protocole tel que décrit comprend un segment sur la base de référence protéine purifiée. Cela a pour but de découvrir la rétention des fenêtres de temps et d'ions précurseurs et fragments appropriés. Ce segment est très utile mais pas indispensable.

<pclass = "jove_content"> Bien que des paires de peptides correspondantes de deux espèces d'intérêt peuvent être énumérés, même sans expérience, il est parfois le cas où une différence de séquence a des conséquences dramatiques sur le profil de digestion. Par exemple, la paire de peptide VLGFHG (bœuf) et ELGFQG (cheval) donnent un résultat de quantification anormale (manifeste comme un gradient inférieur à celui de la figure 2). En effet, le dernier peptide provient d'un clivage KE relativement supprimée, ce qui provoque une sous-estimation du niveau de cheval dans le mélange. peptides correspondants à partir de différents acides aminés sont donc à éviter. Souvent, les fragments de deux peptides correspondants ont des séquences d'acides aminés et sont bien comportés, mais ce n'est pas toujours le cas et doit être vérifiée au cours du développement de la méthode. L'identification des espèces est beaucoup moins sensible à ces questions que la quantification relative.

Le protocole a été démontrée pendant quatre viandes rouges³ s. espèces de viande supplémentaires peuvent être inclus, mais la qualité de la forme du pic de transition peut se détériorer si trop de peptides marqueurs co-éluent, réduisant le temps de séjour et, finalement, dégradant les estimations relatives de quantification. L'amélioration de l'instrumentation, déjà disponible, permettra d'améliorer cela. Une question connexe est que toutes les viandes ont des myoglobine. Par exemple, le cheval, l'âne et la myoglobine zébrées sont identiques et donc à proprement parler de la méthode est seulement capable de détecter cheval ou âne ou zèbre dans la viande bovine. Dans certains cas, même si la myoglobine ne sont pas identiques, certains peptides clés peuvent être. Par exemple, certains peptides marqueurs agneau myoglobine dérivé apparaissent également chez la chèvre.

Une complication face à ceci et toute autre méthode de quantification à base de protéines est que le niveau de la protéine doit être supposé constant dans toutes les espèces si les niveaux de protéine ou de peptide sont d'assimiler trivialement à des niveaux de viande en mélange. Pour la myoglobine et les quatre rouge mmange ce n'est pas universellement vrai. Les niveaux en général sont des espèces dépendantes, avec du porc présentant le niveau le plus bas des quatre. En outre, le niveau de myoglobine varie avec la coupe de viande et de l'âge des animaux. Donc, bien que des rapports de zones de pic de transition carte de manière fiable à des ratios de myoglobine, le mappage ratio des viandes réelles est un dessin d'estimation sur des hypothèses concernant les sources probables des viandes dans le mélange.

L'approche décrite dans ce travail diffère dans un certain nombre de façons d'autres contributions publiées. Une route plus typique est d'utiliser des méthodes protéomiques pour identifier divers peptides marqueurs disparates espèces dépendantes, dans ce cas , les marqueurs pour les différentes espèces possèdent pas de relation particulière avec l'autre ^8-12,14,19. En revanche, nous avons sélectionné des protéines communes à toutes les espèces d'intérêt jusqu'à des espèces dépendantes des variants de séquence ^3. En plus d'être le centre de notre stratégie par rapport à la quantification, ceci présente l'avantage que l'échantillonles stratégies de préparation peuvent être optimisés. En outre, ces protéines correspondantes sont susceptibles de se comporter de façon similaire, par exemple, dans l'extraction ou la transformation commerciale d'échantillons, tels que la cuisson ou la mise en conserve. L'identification des espèces procède alors normalement via la détection de peptides marqueurs disparates, alors que dans l'approche CPCP identification des espèces produit via la détection de peptides étroitement apparentés qui possèdent généralement une ou deux différences de séquence. Enfin, la quantification des protéines pour estimer le pour cent en poids d'une espèce à une autre peut procéder classiquement par l' intermédiaire d'une quantification absolue de chaque protéine basée sur des standards connus séparément ^7,14,15. Cependant, l'utilisation de la méthode de CPCP il n'y a pas besoin de méthodes d'étalonnage. Au lieu de cela, les niveaux relatifs sont estimés en comparant les intensités de signal des deux peptides correspondants des deux espèces, sans passer par l'étape de mesure absolue au total. Étant donné que le but ultime est un pourcentage en poids d'une espèce dans another, une quantification relative, le CPCP est à la fois plus directe et plus simple que de comparer deux mesures de quantification absolue. Ces caractéristiques se traduisent par des courts expérimentaux, prévus pour être environ deux heures en utilisant des protocoles raffinés, ce qui rend la technique utile comme outil de surveillance rapide dans le domaine de la détection des fraudes alimentaires.

Materials

Uniprot database	www.uniprot.org		Freely accessible database of protein sequences
Skyline software	www.skyline.gs.washington.edu		Free software to download that enables the creation of targeted methods for proteomic studies, peptide and fragment prediction
Ammonium bicarbonate	Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, UK www.sigmaaldrich.com	O9830
Methanol, HPLC grade	Fisher Scientific, Loughoborough, UK www. fisher.co.uk	10674922
Acetonitrile, HPLC grade	Fisher Scientific, Loughoborough, UK www. fisher.co.uk	10010010
Urea	Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, UK www.sigmaaldrich.com	U5378
Trypsin(from bovine pancreas treated with TPCK)	Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, UK www.sigmaaldrich.com	T1426
Formic acid	Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, UK www.sigmaaldrich.com	F0507
Coomassie Plus Protein Assay Reagent	Thermo Fisher Scientific www.thermofisher.com	1856210
Protein standard	Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, UK www.sigmaaldrich.com	P0914
Ultra Turrax homogeniser T25	Fisher Scientific, Loughoborough, UK www. fisher.co.uk	13190693
Edmund and Buhler KS10 lab shaker
Heraeus Fresco 17 Centrifuge	Thermo Fisher Scientific www.thermoscientific.com	75002420
Vacuum centrifuge RC 1022	Jouan
Plate Reader
Strata-X 33u polymeric reversed-phase cartridges 60 mg/3 ml tubes	Phenomenex, Macclesfield, UK	8B-S100-UBJ
4000 QTrap triple-quadrupole mass spectrometer	AB Sciex, Warrington, UK www.sciex.com
1200 rapid resolution LC system	Agilent, Stockport, UK
XB C18 reversed-phase capillary column (100 x 2.1mm, 2.6µ particle size)	Phenomenex, Macclesfield, UK www.phenomenex.com
Analyst 1.6.2 software	AB Sciex, Warrington, UK www.sciex.com		QTrap data acquisition and analysis, including peak area integration
Autosampler vials