In this antigen-driven colitis model, OT-II CD4+ T cells expressing a red fluorescent protein were adoptively transferred into RAG-/- mice that express a green fluorescent protein in mononuclear phagocytes (MPs). The hosts were challenged with Escherichia coli (E.coli) expressing the ovalbumin protein (OVA) fused to a cyan fluorescent protein (CFP).
Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological mechanisms involved during the disease is the T cell transfer model of colitis. In this model, immunodeficient mice (RAG-/- recipients) are reconstituted with naive CD4+ T cells from healthy wild type hosts.
This model allows examination of the earliest immunological events leading to disease and chronic inflammation, when the gut inflammation perpetuates but does not depend on a defined antigen. To study the potential role of antigen presenting cells (APCs) in the disease process, it is helpful to have an antigen-driven disease model, in which a defined commensal-derived antigen leads to colitis. An antigen driven-colitis model has hence been developed. In this model OT-II CD4+ T cells, that can recognize only specific epitopes in the OVA protein, are transferred into RAG-/- hosts challenged with CFP-OVA-expressing E. coli. This model allows the examination of interactions between APCs and T cells in the lamina propria.
Tarmen är den största ytan av kroppen som är exponerad för den yttre miljön. Stora kedjor av inhemska mikrober koloniserar människans tarm att bilda tarmfloran (eller mikroflora). Detta beräknas bestå av upp till 100 biljoner mikrobiella celler och utgör ett av de mest tätbefolkade bakteriella livsmiljöer som är kända inom biologin 1-3. I GIT bakterierna kolonisera en tarm nisch där de överleva och föröka sig fyra. I gengäld förser mikrobiota värden med ytterligare funktionella egenskaper inte kodas på dess genom en. Exempelvis mikrobiota stimulerar proliferation av epitelceller, producerar vitaminer som är värd inte kan producera själva, reglerar metabolism och skyddar mot patogener 4-6. Med tanke på detta givande relation har vissa författare föreslagit att människor är "super-organismer" eller "holobionts" som är en blandning av bakteriella och mänskliga gener 7,8. Med tanke på de positiva effekterna av mikrobiota på (mänsklig) värd, behöver tarmimmunsystemet att tolerera kommen mikrober för att möjliggöra deras existens i lumen men också döda patogener som invaderar från luminala sidan 9-11. Tarmimmunsystemet har utvecklat mekanismer för att skilja mellan ofarliga och potentiellt skadliga luminala mikrober; men dessa mekanismer är ännu inte väl förstått 12. Att upprätthålla tarm integritet kräver en hårt reglerad immun homeostas att hålla balansen mellan tolerans och immunitet 13. En obalans i immun homeostas bidrar till induktion av tarmsjukdomar såsom inflammatorisk tarmsjukdom (IBD) 3,14.
Det finns två huvudtyper av IBD: Crohns sjukdom (CD) och ulcerös kolit (UC). Patienter med dessa sjukdomar lider vanligtvis från blödning, svår diarré och buksmärtor 15,16. Den enda orsaken till IBD är fortfarandeokänd, men en kombination av genetiska faktorer, miljöfaktorer och oreglerad immunsvar kan vara den viktigaste händelsen för sjukdomsutveckling 15.
Djurmodeller för IBD har använts i över 50 år. Under de senaste decennierna nya IBD modellsystem har utvecklats för att testa olika hypoteser om patogenesen för IBD 17,18. Bäst karakteriserad modell av kronisk kolit är den T-cell-överföringsmodell som inducerar störningar i T-cell homeostas 19,20. Denna modell involverar överföring av naiva T-celler från immunkompetenta möss in i värdar som saknar T- och B-celler (såsom RAG – / – och SCID-möss) 16,21. Utvecklingen av sjukdomen i denna modell övervakas under 3-10 veckor genom att utvärdera närvaron av diarré, minskad fysisk aktivitet, och förlust av kroppsvikt. Detta är så kallade wasting syndrome 16. Jämfört med friska möss kolonvävnad av transplanterade värdar är Thicker, kortare och tyngre 16. Med användning av cellöverföringsmodell T, är det möjligt att förstå hur olika T-cellspopulationer kan bidra till patogenesen av IBD 22. T-cellöverföringsmodell analyserar inte interaktionen mellan APC och T-celler i sjukdomsprocessen på ett antigenspecifikt sätt. Det har visats att en interaktion mellan myeloidceller och lymfoidceller kan vara ansvarig för utvecklingen av tarminflammation 23. Även om många aspekter av IBD har klargjorts, de inledande händelser som leder till sjukdomsutvecklingen måste fortfarande klart.
Det har visat sig att i avsaknad av mikrobiota överförings kolit kan inte fastställas 24. Nyligen har flera teorier tyder på att IBD kan vara ett resultat av ett immunsvar mot bakteriefloran 25. Författarna har också föreslagit att bakteriefloran är nödvändiga för att framkalla inflammation i den distala tarmen26. I bakteriefri (GF) djur tarmimmunsystemet generellt osäkra 27,28, men en kolonisering av dessa möss med en blandning av specifik patogenfria bakterier resulterar i utvecklingen av fullt behöriga tarmimmunsystemet 29. Därför verkar mikroorganismer att vara en nyckelfaktor i patogenesen för IBD, antingen som en mekanism som ökar risken för eller skyddar mot utvecklingen av tarminflammation 30,31. Aktuella teorier tyder på att IBD är ett resultat av mikrobiell obalans, kallad dysbios i genetiskt predisponerade patienter 32, men det är inte klart ännu om dysbios är orsaken eller en följd av sjukdomen 12. Att beakta betydelsen av mikroorganismer i utvecklingen av IBD, in vitro-experiment visade att CD4 + T-celler kan aktiveras av APC pulserade med tarmbakterier 33,34.
Vidare har det visats att antigener frånolika commensal bakteriella arter, såsom E. coli, Bacteroides, Eubacterium och Proteus, kan aktivera CD4 + T-celler 35. Detta indikerar att presentation av bakteriella antigener till T-celler är av betydelse för utvecklingen av IBD. För att minska komplexiteten hos multipla antigener härledda genom mikrofloran i sjukdomsprocessen, har en E. coli-stam skapats som producerar OVA-antigenet. Överföring kolit inducerades genom att injicera OVA-specifika T-celler in i RAG – / – djur koloniserade med OVA-uttryckande E. coli.
Denna modell bygger på bevis som tyder på att CX 3 CR1 + MPs, en stor cell delmängd i kolon lamina propria (CLP) 36, interagerar med CD4 + T-celler under överföringen kolit 37. MPs prov tarmlumen för partiklar antigen, såsom bakterier, med hjälp av sina dendriter 36, 38,39. Tidigare studiervisade att MPs också kan ta upp lösliga antigener, såsom OVA, som förs in i tarmen lumen 40,41. Med tanke på det överflöd av CX 3 CR1 + MPs i CLP, är det möjligt att dessa celler kan prova luminala bakterier och interagera med CD4 T-celler. Konfokal avbildning av möss transplanterades med OVA-specifika CD4 + T-celler koloniserade med E. coli GFP-OVA, visar att CX 3 CR1 + MPs är i kontakt med OT-II CD4 + T-cell under utvecklingen av antigen-driven kolit. Denna modell möjliggör studiet av antigenpresentation processen mellan intestinala APC och T-celler specifika endast för särskilda antigen-uttryckande bakterier i tarmlumen.
Som med alla andra modell, kan den antigendrivna kolit modell som beskrivs ovan presenterar några frågor som utredaren utför tekniken måste vara medveten om. Vid injektion OT-II / Red + CD4 + T CD62L + celler i värdar, måste utredaren vara mycket försiktig och noga med att sätta in nålen in i bukhålan. Underlåtenhet att göra detta kan resultera i sönderslitning av tarmen hos musen som kan leda till döden, eller en subkutan administrering av celler som inte framkallar någon…
The authors have nothing to disclose.
JHN is supported by the Swiss National Foundation (SNSF 310030_146290).
LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Difco | 244620 | |
Rotary Shake | Reiss Laborbedarf e. K. | Model 3020 GFL | |
2 mm gap couvettes | Peqlab Biotechnologie GmbH | 71-2020 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-100ML | |
Gene Pulser Xcell system | BioRad Laboratories GmbH | 1652660 | |
LB Agar, Miller (Luria-Bertani) | Difco | 244510 | |
Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9393-5G | |
SOC Medium | Sigma-Aldrich | S1797-100ML | |
High Pure Plasmid Isolation Kit | Roche | 11754777001 | |
Agarose | Carl Roth GmbH & Co | 3810.1 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E9884-100G | |
Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
Glacial acetic acid | Sigma-Aldrich | 537020 | |
Gel chamber | PEQLAB Biotechnology GmbH | 40-0708 | |
Loading Dye | Thermo Fisher | R0611 | |
GeneRuler 1 kb DNA Ladder | Thermo Fisher | SM0312 | |
Ethidium bromide solution | Carl Roth GmbH & Co. KG | 2218.3 | |
Photo-documentation system | Decon Science Tech GmbH | DeVision G | |
DNA sequencing | MWG-Biotech GmbH | ||
Phosphate buffered saline (PBS) | Biochrom | L182-50 | |
Fluorescent microscope | Zeiss | HBO 100 | |
Mini-PROTEAN Tetra System | Bio-Rad Laboratories GmbH | 1658005 | |
PageRuler Prestained Protein Ladder | Fermentas, St. Leon-Rot, Germany | ||
IstanBlue Solution | Expedeon, Cambridgeshire, United Kingdom | ||
Nitrocellulose membrane | Macherey-Nagel GmbH & Co. KG | 741280 | |
Electro blotter | Biometra GmbH | 846-015-600 | |
Bovine Serum Albumins (BSA) | Sigma-Aldrich | A6003-25G | |
Anti-Ovalbumin antibody | Abcam | ab181688 | |
Anti-rabbit IgG HRP | Sigma-Aldrich | A0545 | |
Pierce ECL Plus Western Blotting Substrate | Pierce Biotechnology, Thermo Fischer Scientific Inc | 32132 | |
Forene | Abbott | 2594.00.00 | |
FBS | Invitrogen | 10500-064 | |
Falcon Cell Strainers | Fischer Scientific | 08-771-19 | |
Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | 254134-5G | |
Tris Base | Sigma-Aldrich | 10708976001 | |
CD4+ CD62 L+ T isolation kit | Miltenyi Biotec | 130-093-227 | |
MACS LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
MACS MS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
MidiMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
MiniMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
Feeding Needle 20G | SouthPointe Surgical Supply, Inc | FN-7903 | |
Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
Paraffin | Sigma-Aldrich | 1496904 | |
Hematoxylin | Sigma-Aldrich | H9627 | |
Eosin Y | Sigma-Aldrich | 230251 | |
Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D9779 | |
Collagenase type VIII | Sigma-Aldrich | C-2139 | |
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium | AppliChem | A2044, 9050 | |
Percoll (density 1.124 g/ml) | Biochrome | L-6145 | |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | 438456 | |
Mouse BD Fc Block | BD Pharmingen | 553141 | |
FITC-conjugated mAb binding Vß 5.1, 5.2 | BD Pharmingen | 553189 | |
APC-conjugated mAb binding CD4 GK1.5 | eBioscience | 17-0041-83 | |
FACS Calibur | BD Biosciences | ||
FCS Express V3 software | DeNovo | ||
Meta scanning confocal microscope | Zeiss | LSM 710 | |
Zeiss Workstation | Zeiss | LSM 7 | |
Zeiss ZEM software | Zeiss | v4.2.0.121 | |
Maxisorp immuno plates | NUNC, Roskilde | 442404 | |
Streptavidin conjugated alkaline phosphatase | Jackson Immuno Research | 016-050-084 | |
Alkaline phosphatase substrate 4-Nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate | Sigma-Aldrich | 71768-5G | |
mAb R4-6A2 | BD Biosciences | 551216 | |
mAb XMG1.2 | BD Biosciences | 554410 | |
TECAN microplate-ELISA reader | Tecan | ||
EasyWin software | Tecan |