House Ear Institute-Organ of Corti 1 (HEI-OC1) is one of the few mouse auditory cell lines currently available for research purposes. This protocol describes how to work with HEI-OC1 cells to investigate the cytotoxic effects of pharmacological drugs as well as functional properties of inner ear proteins.
HEI-OC1 is one of the few mouse auditory cell lines available for research purposes. Originally proposed as an in vitro system for screening of ototoxic drugs, these cells have been used to investigate drug-activated apoptotic pathways, autophagy, senescence, mechanism of cell protection, inflammatory responses, cell differentiation, genetic and epigenetic effects of pharmacological drugs, effects of hypoxia, oxidative and endoplasmic reticulum stress, and expression of molecular channels and receptors. Among other several important markers of cochlear hair cells, HEI-OC1 cells endogenously express prestin, the paradigmatic motor protein of outer hair cells. Thus, they can be very useful to elucidate novel functional aspects of this important auditory protein. HEI-OC1 cells are very robust, and their culture usually does not present big complications. However, they require some special conditions such as avoiding the use of common anti-bacterial cocktails containing streptomycin or other antibiotics as well as incubation at 33 °C to stimulate cell proliferation and incubation at 39 °C to trigger cell differentiation. Here, we describe how to culture HEI-OC1 cells and how to use them in some typical assays, such as cell proliferation, viability, death, autophagy and senescence, as well as how to perform patch-clamp and non-linear capacitance measurements.
Maison-oreille Institut organe de Corti 1 (CP1) HEI-cellules sont dérivées de l'organe auditif d'un 1,2 de souris transgéniques. L' incubation d'une cellule à partir de cette souris transgénique à 33 ° C / 10% de CO 2 (conditions permissives) induit l' expression d'un gène immortalisant qui déclenche la dé-différenciation et de la prolifération accélérée; en déplaçant les cellules à 39 ° C / 5% de CO 2 (conditions non permissives) conduisent à une diminution de la prolifération, la différenciation et, au moins dans le cas de HEI-OC1, la mort cellulaire 2,3.
cellules HEI-OC1 ont été clonés et caractérisés dans notre laboratoire il y a plus d'une décennie, et les études initiales ont indiqué qu'ils expriment des marqueurs spécifiques des cellules ciliées de la cochlée, comme prestine, myosine 7a, Atoh1, BDNF, calbindine et calmoduline, mais aussi des marqueurs de soutien des cellules telles que la connexine 26 et le récepteur du facteur de croissance des fibroblastes (FGF-R) 2. Par conséquent, il a été suggéré que HEI-OC1 pourrait représenter un common progénitrices des cellules sensorielles et de soutien de l'organe de Corti 2. Des études parallèles fournis des preuves solides que archétypales médicaments ototoxiques comme le cisplatine, la gentamicine et streptomycine caspase-3 activation induite dans ces cellules, tandis que les médicaments considérés comme non-ototoxiques, comme la pénicilline, ne l' ont pas 2,3. Par conséquent, cette lignée cellulaire a été proposé comme un système in vitro pour étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans l' ototoxicité et pour le dépistage de l'ototoxicité potentiel ou propriétés otoprotective de nouveaux médicaments pharmacologiques. On estime que les cellules HEI-OC1 ont été utilisés dans plus de cent cinquante études publiées au cours des dix dernières années.
Considérant que , en regardant l'effet pro-apoptotique potentiel des différents médicaments a été le principal objectif de la plupart des études portant sur cette lignée cellulaire, d' autres processus cellulaires importants tels que l' autophagie et la sénescence ont tout juste commencé à étudier dans les cellules HEI-OC1 4-7. jena étude récente de notre laboratoire 8, nous avons utilisé des cellules HEI-OC1 pour collecter un ensemble complet de données sur la mort cellulaire, la survie, la prolifération, la sénescence et l' autophagie induite par différents médicaments pharmacologiques fréquemment utilisés dans la clinique. Nous avons également comparé certaines des réponses des cellules HEI-OC1 avec ceux de HEK-293 (cellules rénales embryonnaires humaines) et des cellules HeLa (cellules épithéliales humaines) recevant un traitement identique. Nos résultats indiquent que les cellules HEI-OC1 répondent à la chaque médicament d'une manière typique, avec une dose unique et de la sensibilité en fonction du temps à au moins l'un des mécanismes à l'étude. Nous avons également souligné dans cette étude qu'une interprétation correcte des résultats expérimentaux , il faudra effectuer des études parallèles avec plus d'une technique 8.
Dans une autre étude , nous avons étudié l'utilisation de cellules HEI-OC1 pour évaluer la réponse fonctionnelle de prestine, la protéine motrice de cellules externes cochléaires de cheveux (CCEs) 9 </sup>. Nous avons signalé cytométrie en flux et des études de microscopie confocale à balayage laser sur le motif d'expression prestine, ainsi que la capacité non linéaire (NLC) et des études de serrage des cellules plaquées entières dans les cellules HEI-OC1 cultivées à permissive (P-HEI-OC1) et non permissives (NP-HEI-OC1) conditions. Nos résultats indiquent que les deux augmentation de la localisation de l'expression Prestin et de la membrane plasmatique totale d'une manière dépendant du temps dans les cellules NP-HEI-OC1. Chose intéressante, nous avons également constaté que l'augmentation de la localisation Prestin à la membrane plasmique des cellules NP-HEI-OC1 en corrélation avec une diminution de la Na + K + ATPase, qui translocation de la membrane plasmique vers le cytoplasme sans changements significatifs dans l' expression totale des cellules. De plus, nous avons démontré que les cellules P-HEI-OC1 ont un solide CNL associé à Prestin la fonction motrice, ce qui diminue lorsque la densité des molécules de Prestin présentes à la membrane plasmatique augmente. Au total, ces résultats appuient fortement l'utilité de HEI-OC1 cellules pour étudier les protéines auditives.
Dans cet article, vidéo, nous décrivons comment la culture de cellules HEI-OC1, pourquoi il est commode d'utiliser des cellules de plus en plus dans des conditions permissives (P-HEI-OC1) pour les études de cytotoxicité, comment évaluer le mécanisme / s de la cytotoxicité induite par le médicament et comment d'effectuer des études électrophysiologiques (par exemple, patch-clamp, la capacité non-linéaire (NLC)) pour étudier les propriétés fonctionnelles des prestine, le moteur moléculaire CCEs cochléaires.
Dans ce rapport, nous décrivons comment la culture de cellules HEI-OC1 et les utiliser pour évaluer les mécanismes de la cytotoxicité induite par le médicament et d'étudier les propriétés fonctionnelles des prestine, le moteur moléculaire cochléaire CCEs. Les procédures techniques, cependant, sont suffisamment généraux pour être facilement adapté à différentes études.
Tous les protocoles décrits ici nécessitent l'utilisation correcte des techniques de culture cell…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by NIH Grants R01-DC010146 and R01-DC010397. Its content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official view of the National Institutes of Health.
HEI-OC1 cells | ALL THE ASSAY KITS, EQUIPMENTS | ||
Class II Biological Safety cabinet | The Baker Company | Sterilgard III | AND COMPANIES INDICATED IN THE |
Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5810R | PREVIOUS 2 COLUMNS ARE ONLY |
Inverted microscope | Zeiss | Axiovert 25 | EXAMPLES, AND ANY OTHER SIMILAR |
Waterbath | Stovall | HWB115 | PRODUCT COULD BE USED. |
Cell counter | Nexcelom | Cellometer Auto T4 | |
Two (2) Cell incubators, one at 33°C/10% CO2 and other at 39°C/5% CO2 | Forma Scientific | 3110 | |
Cell culture dishes, PS, 100 x 20 mm with vents | Greinier Bio-One | 664-160 | |
Cell culture dishes , PS, 60 x 15 mm with vents | Greiner Bio-One | 628160 | |
Cellstar tissue culture flasks 250 mL | Greiner Bio-One | 658-175 | |
Cellstar tissue cultur flasks 550 mL | Greiner Bio-One | 660-175 | |
6 well cell culture plate, with lid-Cellstar | Greiner Bio-One | 657-160 | |
Microtest Tissue culture plate, 96 well,flat bottom with lid | Becton Dickinson | 353072 | |
Micro-Assay-Plate, Chimmey, 96-well white,clear botton | Greiner Bio-One | 655098 | |
50 ml Polypropylene conical tube with cap Cellstars | Becton Dickinson | 352070 | |
15 ml Polypropylene conical tubes with cap-Cellstars | Greiner Bio-One | 188-271 | |
PBS pH 7.4 (1X) | Life Technologies | 10010-023 | |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965-084 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH10073.1 | |
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | Gibco/Invitrogen | 21083-027 | |
Trypsin, 0.25% | Life Technologies | 25200-056 | |
TACS MTT Cell Proliferation Assay Kit | Trevigen | 4890-25-K | |
Caspase-Glo 3/7 Assay kit | Promega | G8091 | |
BrdU Cell Proliferation Assay Kit | Cell Signaling | 6813 | |
Non-enzymatic cell dissociation solution | Sigma-Aldrich | C5789 | |
Cell-Tox Green Cytotoxicity Assay Kit | Promega | G8741 | |
FACSAriaIII instrument | BD Biosciences | FACSAriaIII | With 488 nm excitation (blue laser) |
Digital Blot Scanner | LI-COR | C-DiGit | |
Electrophoresis and Blotting Unit | Hoefer | SE300 miniVE | |
Spectra Max 5 Plate Reader with Soft Max Pro 5.2 Software | Molecular Devices | SpectraMax 5 | |
Patch-clamp amplifier | HEKA | EPC-10 | |
Puller for preparing patch electrodes | Sutter Instruments | P-97 |