डिजाइन और एक कम लागत का उपयोग, बैक्टीरिया की अनुकूली विकास के लिए एंटीबायोटिक दवा चयन के तहत स्वचालित Morbidostat
Summary
We describe a low cost, configurable morbidostat that enables the characterization of antibiotic drug resistance by dynamically adjusting the drug concentration. The device can be integrated with a multiplexed microfluidic platform. The approach can be scaled up for laboratory antibiotic drug resistance studies.
Abstract
हम एंटीबायोटिक प्रतिरोध के विकासवादी मार्ग निस्र्पक के लिए एक कम लागत, विन्यास morbidostat का वर्णन है। morbidostat एक जीवाणु संस्कृति युक्ति है कि लगातार बैक्टीरिया विकास पर नजर रखता है और गतिशील दवा एकाग्रता समायोजित लगातार बैक्टीरिया को चुनौती के रूप में वे दवा प्रतिरोध हासिल करने के लिए तैयार है। डिवाइस ~ 10 मिलीलीटर की एक काम की मात्रा की सुविधा है और पूरी तरह से स्वचालित और ऑप्टिकल घनत्व माप और मध्यम और दवा वितरण के लिए सूक्ष्म पंप के साथ सुसज्जित है। मंच को मान्य करने के लिए, हम कोलाई एमजी 1655 में trimethoprim प्रतिरोध का चरणबद्ध अधिग्रहण मापा जाता है, और सेल आकृति विज्ञान और एंटीबायोटिक संवेदनशीलता जांच के लिए एक मल्टिप्लेक्स microfluidic मंच के साथ डिवाइस एकीकृत। दृष्टिकोण हो सकता है एंटीबायोटिक दवा प्रतिरोध की प्रयोगशाला अध्ययन करने के लिए ऊपर पहुंचा, और चयापचय इंजीनियरिंग और अन्य जीवाणु संस्कृति प्रयोगों में तनाव के सुधार के लिए विकास अनुकूली के लिए लचीला है।
Introduction
पहली एंटीबायोटिक दवा पेनिसिलिन की शुरूआत के बाद से, माइक्रोबियल एंटीबायोटिक प्रतिरोध एक वैश्विक स्वास्थ्य समस्या 1 में विकसित किया है। हालांकि एंटीबायोटिक प्रतिरोध के अधिग्रहण पूर्वव्यापी विवो में अध्ययन किया जा सकता है, इन प्रयोगों की स्थिति अक्सर संपूर्ण विकास 2 के दौरान नियंत्रित नहीं कर रहे हैं। वैकल्पिक रूप से, अनुकूली प्रयोगशाला विकास एक एंटीबायोटिक दवा 3 से पर्यावरण तनाव या दबाव में चयन एक माइक्रोबियल प्रजातियों के आणविक विकास प्रकट कर सकते हैं। हाल ही में, कई अच्छी तरह से नियंत्रित एंटीबायोटिक दवा प्रतिरोध के विकासवादी प्रयोगों एंटीबायोटिक दवा प्रतिरोध के उद्भव स्पष्ट कर दिया है। उदाहरण के लिए, ऑस्टिन के समूह एक ठीक से इंजीनियर microfluidic compartmented पर्यावरण 4 में तेजी से उभार का प्रदर्शन किया। हाल ही में विकसित morbidostat दवा चयन दबाव 5,6 के तहत व्यवस्थित म्यूटेशन लाती है। morbidostat, एक माइक्रोबियल selection युक्ति है कि लगातार एंटीबायोटिक एकाग्रता समायोजित लगभग निरंतर आबादी बनाए रखने के लिए, सूक्ष्म जीव विज्ञान में उतार-चढ़ाव 7.8 में इस्तेमाल की परीक्षा से एक प्रमुख अग्रिम है। उतार-चढ़ाव के परीक्षण में, एक एंटीबायोटिक दवा उच्च एकाग्रता में इंजेक्ट किया जाता है, और जीवित रहने का म्यूटेंट जांच की और गिने जाते हैं। इसके बजाय, एक morbidostat में रोगाणुओं को लगातार चुनौती दी और कई उत्परिवर्तन प्राप्त कर रहे हैं।
Morbidostat chemostat, एक संस्कृति डिवाइस 1950 में Novick और Szliard द्वारा आविष्कार किया है कि लगातार पोषक तत्वों की आपूर्ति जबकि माइक्रोबियल आबादी 9 गिराए द्वारा एक निरंतर जनसंख्या का कहना है के लिए इसी तरह चल रही है। इसकी शुरूआत के बाद से, chemostat उन्नत और सुधार किया गया है। वर्तमान microfluidic chemostats nanoliter और एकल कोशिका क्षमता पर पहुंच गया है। हालांकि, इन उपकरणों अनुकूली विकास प्रयोगों, जो कई उत्परिवर्तन घटनाओं 10,11 के साथ एक बड़ी सेल की आबादी की आवश्यकता के लिए अनुपयुक्त हैं। हाल ही में, मिनी~ 10 मिलीलीटर की मात्रा में काम कर रहे हैं साथ chemostats भी लीटर पैमाने बायोरिएक्टर और microfluidic chemostat 12,13 के बीच की खाई को भरने के लिए विकसित किया गया है।
यहाँ हम एक एंटीबायोटिक दवा प्रतिरोध के अध्ययन के लिए डिजाइन और एक कम लागत का उपयोग करते हैं, स्वचालित morbidostat प्रस्तुत करते हैं। प्रस्तावित मॉड्यूल न्यूनतम हार्डवेयर आवश्यकता के साथ एक सूक्ष्म जीव विज्ञान प्रयोगशाला में एक प्रकार के बरतन इनक्यूबेटर में नियोजित किया जा सकता है। खुला स्रोत फर्मवेयर भी आसानी से इस तरह के चयापचय इंजीनियरिंग 3 के रूप में अनुकूली विकास के विशिष्ट अनुप्रयोगों, के अनुरूप है। अंत में, morbidostat एंटीबायोटिक संवेदनशीलता परीक्षण 14 के लिए एक मल्टिप्लेक्स microfluidic मंच में एकीकृत है।
Protocol
Representative Results
Discussion
कम लागत वाली घटकों से एक कम पदचिह्न morbidostat डिवाइस प्रदर्शन किया है। डिवाइस द्वारा पंजीकृत दवा प्रतिरोध स्तर में वृद्धि पिछली रिपोर्टों 5 में से उन लोगों के साथ संगत कर रहे हैं। दवा प्रतिरोध के विकासव…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Prof. Sze-Bi Hsu and Ms. Zhenzhen for useful discussions and help in the theoretical analysis and numerical simulation. Y. T. Y. would like to acknowledge funding support from the Ministry of Science and Technology under grant numbers MOST 103-2220-E-007-026 and MOST 104-2220-E-007-011, and from the National Tsing Hua University under grant numbers 103N2042E1, 104N2042E1, and 105N518CE1.
Materials
| Environmental Shaker Incubator | BioSan | ES-20 | |
| Arduino Leonardo board | Arduino | Leonardo | |
| 680 Ohm Carbon Resistor | Digikey | Bias resistor for LED | |
| 100k Ohm Carbon resistor | Digikey | Bias resistor for phototransistor | |
| 940 nm light emitting diode | Bright LED Electronic | BIR-BM13E4G-2 | Optical density measurement |
| 940 nm phototransistor | Kodenshi | ST-2L2B | Optical density measurement |
| Darlington pair IC Toshiba | Mouser | ULN2803APG | this IC drives micropumps and magnetic stirring unit |
| 5V DC brushless fan | ADDA | AD0405LX-G70 | spec: 5V supply voltage and 80mA available www.jameco.com |
| Piezoelectric micropump | CurieJet | PS15I-FT-5L | Pressure >3kPa Flow rate >5 ml/min |
| Tygon 3350 Tuning | Saint Gobain | ABW00001 | ID: 1/32" OD: 3/32" L:50' |
| Magnetic Stir bar | COWIE | tapered shape dim: 10 mm x 4mm | |
| Glass scintillation 20ml vial | DGS | Pyrex glass 28mm(dia.)x 61 mm(h) | |
| Culture vial holder | Custom made from Polyformaldehyde | ||
| Silicone | Dow Corning | Sylgald 184 | used to seal the glass vial |
| Medium bottle | VWR | 66022-065 | |
| Difco M9 minimal salt 5x | BD | Medium | |
| Cadamino Acid | BD | Medium | |
| glucose | Sigma | ||
| Agar Bateriological | Oxoid | for agar plate | |
| Luria Bertani medium | |||
| Inverted microscope | Leica Microsystems | Leica DMI-LED | used for microfluidic measurement Use X40 objective NA=0.55 |
| Microscope Incubator | Live Cell Instrument | CU-109 | used for microfluidic measurement |
| Solenoidal valves | Pneumadyne | S10MM-31-12-3 | Normally open 1.3 Watt 12 Vdc |
| USB interface card | Hobby Engineering | USBIO24-R Digital I/O Module | for microfluidics measurement |
| Air compressor | Rocker Scientific | ROCKER 440 | Pressure source for microfluidcs Max. Pressure 80 Psi |
| Male luer-lock fittings to 1/8" barb | ValuePlastics.com | MTLL230-1 | used for microfluidic control |
| 1/8" barb to 10-32 threaded port | ValuePlastics.com | B-1 | used for microfluidic control |
| Female luer-lock fittings to 10-32 threaded port | ValuePlastics.com | KFTL-1 | used for microfluidic control |
| NPN darlington transistor 500mA, 40V (2N6427) | DigiKey.com | 2N6427GOS-ND | used for microfluidic control |
| 10kOhm, carbon film resistor, 0.25W | DigiKey.com | P10KBACT-ND | used for microfluidic control |
| Tantalum capacitor, 10uF, 25V, 10% | DigiKey.com | 478-1841-ND | used for microfluidic control |
| Andor CCD camera | Andor | Zyla 4.2 Plus SCMOS | used for microfluidic on chip imaging |
| ELISA plate reader | |||
| two component Silicone | Momentive | RTV 615 | used for microfluidic chip fabrication |
| SU-8 photoresist | Micrchem | SU8 2015 | used for microfluidic chip fabrication |
| AZ4620 photoresist | Clariant | AZ 4620 | used for microfluidic chip fabrication |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC 32G | used for microfluidic chip fabrication |
| 20 Gauge Syringe Needle | BD | used for microfluidic chip fabrication | |
| Labcycler | Sensoquest | Labcycler | PCR |
| DNA polymerase | Toyobo | KDO Plus | PCR amplification |
| Trimethoprim | Sigma | ||
| Plate reader | Biotek | Synergy H1 hybrid | antibiotic resistane measurement |
References
- Levy, S. B., Marshall, B. Antibiotic resistance worldwide: causes, challenges, and responses. Nat. Med. 10, s122-s129 (2004).
- Wang, M. M., et al. Tracking the in vivo evolution of multidrug resistance in Staphylococus aureus by whole genome sequencing. Pro. Natl. Acad. Sci. 104, 9451 (2007).
- Dragosits, M., Mattanovich, D. Adaptive laboratory evolution – principles and applications for biotechnology. Microbial Cell Factory. 12, 64 (2013).
- Zhang, Q., et al. Acceleration of emergence of bacterial antibiotic resistance in connected microenvironment. Science. 333, 1764-1767 (2011).
- Toprak, E., Veres, A., Michel, J. B., Chait, R., Hartl, D. L., Kishony, R. Evolutionary paths to antibiotic resistance under dynamically sustained drug selection. Nature Genetics. 44, 101-106 (2012).
- Toprak, E., et al. Building a morbidostast: an automated continuous culture device for studying bacterial drug resistance under dynamically sustained drug inhibition. Nature Protocol. 8, 555-567 (2013).
- Rosenthal, A. Z., Elowitz, M. B. Following evolution of bacterial antibiotic resistance in real time. Nature Genetics. 44, 11-13 (2012).
- Young, K. In vitro antibacterial resistance selection and quantitation. Curr Protoc Pharmacol. , (2006).
- Novick, A., Szilard, L. Experiments with the Chemostat on spontaneous mutations of bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 36, 708-719 (1950).
- Balagadde, F. K., You, L., Hansen, C. L., Arnold, F. H., Quake, S. R. Long-term monitoring of bacteria undergoing programmed population control in a microchemostat. Science. 309, 137-140 (2005).
- Groisman, A., et al. A microfluidic chemostat for experiments with bacterial and yeast cells. Nat. Methods. 2, 685-689 (2005).
- Miller, A. W., Befort, C., Kerr, E. O., Dunham, M. J. Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays. J. Vis. Exp. (72), e50262 (2013).
- Takahashi, C. N., Miller, A. W., Ekness, F., Dunham, M. J., Klavins, E. A low cost, customizable turbidostat for use in synthetic circuit characterization. ACS Synthetic Biology. , (2015).
- Mohan, R., et al. A multiplexed microfluidic platform for rapid antibiotic susceptibility testing. Biosens Bioelectrons. 49, 118-125 (2013).
- Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288, 113-116 (2000).
- Kellogg, R. A., Gomez-Sjoberg, R., Leyrat, A. A., Tay, S. . Nat. Protocols. 9, 1713 (2014).
- Gu, G. Y., Lee, Y. W., Chiang, C. C., Yang, Y. T. A nanoliter microfluidic serial dilution bioreactor. Biomicrofluidics. 9, 044126 (2015).
- Gonzalez, R. C., Woods, R. E., Eddins, S. L. . Digital image using Matlab processing. , (2004).
- Heikkila, E., Sundstrom, L., Huovinen, P. Trimethoprim resistance in Escherichia coli isolates from a geriatric unit. Antimicrob. Agents Chemother. 34, 2013-2015 (1990).
- Flensburg, J., Skold, O. Massive overproduction of dihydrofolate reductase in bacteria as a response to the use of trimethoprim. Eur. J. Biochem. 162, 473-476 (1987).
- Ohmae, E., Sasaki, Y., Gekko, K. Effects of five-tryptophan mutations on structure, stability and function of Escherichia coli dihydrofolate reductase. J. Biochem. 130, 439-447 (2001).
- Smith, D. R., Calvo, J. M. Nucleotide sequence of dihydrofolate reductase genes from trimethoprim-resistant mutants of Escherichia coli. Evidence that dihydrofolate reductase interacts with another essential gene product. Mol. Gen. Genet. 187, 72-78 (1982).
- Okumus, B., Yildiz, S., Toprak, E. Fluidic and microfluidic tools for quantitative systems biology. Curr Opin Biotech. 25, 30-38 (2014).
- Cho, J., et al. A rapid antimicrobial susceptibility test based on single-cell morphological analysis. Sci. Transl. Med. 17, 267 (2014).
- Hsu, S. B., Waltman, P. E. Analysis of a model of two competitors in a chemostat with an external inhibitor. SIAM J. Applied Math. , 528-540 (1992).
- Fu, W., et al. Maximizing biomass productivity and cell density of Chlorella vulgaris by using light-emitting diode-based photobioreactor. J. Biotech. 161, 242-249 (2012).
- Peabody, V. G. L., Winkler, J., Kao, K. C. Tools for developing tolerance to toxic chemicals in microbial systems and perspectives on moving the field forward and into the industrial setting. Curr Opin in Chem Eng. 6, 9-17 (2014).
