We describe a low cost, configurable morbidostat that enables the characterization of antibiotic drug resistance by dynamically adjusting the drug concentration. The device can be integrated with a multiplexed microfluidic platform. The approach can be scaled up for laboratory antibiotic drug resistance studies.
Vi beskriver en lav kostnad, konfigurerbar morbidostat for å karakterisere den evolusjonære vei av antibiotikaresistens. Den morbidostat er en bakteriekultur enhet som kontinuerlig overvåker bakterievekst og dynamisk justerer legemiddelkonsentrasjonen å stadig utfordre de bakteriene som de utvikler seg til å erverve resistens. Enheten har et arbeidsvolum av ~ 10 ml og er helautomatisk og utstyrt med optisk tetthet måling og mikro-pumper for medium og levering av legemidler. For å validere plattformen, målte vi trinnvis oppkjøp av trimetoprim motstand i Escherichia coli MG 1655, og integrert enhet med en multiplekset microfluidic plattform for å undersøke celle morfologi og antibiotika mottakelighet. Tilnærmingen kan være opp-skalert til laboratoriestudier av antibiotika narkotika motstand, og er utbyggbar adaptive evolusjon for belastningsskader forbedringer i metabolske engineering og andre bakteriekultur eksperimenter.
Siden innføringen av de første antibiotikum stoffet penicillin, og mikrobiell resistens utviklet seg til et globalt helseproblem 1. Selv om oppkjøpet av antibiotikaresistens kan retrospektivt studert in vivo, er betingelsene for disse forsøkene ofte ikke kontrollert gjennom hele evolusjonen to. Alternativt kan adaptive laboratorium evolusjon avsløre molekylær evolusjon av en mikrobiell arter under miljømessige påkjenninger eller utvalg press fra en antibiotika narkotika tre. Nylig har mange velkontrollerte evolusjonseksperimenter av antibiotisk medikamentresistens belyst fremveksten av antibiotisk resistens. For eksempel, Austin gruppe demonstrert raske fremveksten i en skikkelig konstruert microfluidic compartmented miljø fire. Det nyutviklede morbidostat induserer systematiske mutasjoner i henhold til narkotikaseleksjonstrykk 5,6. Den morbidostat, en mikrobiell selecsjon anordning som kontinuerlig justerer antibiotisk konsentrasjon for å opprettholde en nesten konstant befolkning, er et stort fremskritt fra fluktuasjonsprøven brukes i mikrobiologi 7,8. I fluktuasjonsprøven er et antibiotisk stoff injisert ved høy konsentrasjon, og de overlevende mutanter er vist og telles. I stedet er mikrober i en morbidostat stadig utfordret og skaffe flere mutasjoner.
Den morbidostat virker på samme kjemostat, en dyrkingsanordning oppfunnet av Novick og Szliard i 1950 som opprettholder en konstant befolkning ved kontinuerlig tilførsel av næringsstoffer samtidig fortynning av den mikrobielle populasjonen 9. Siden lanseringen har kjemostaten er avansert og forbedret. Nåværende microfluidic chemostats har nådd nanoliter og encellede kapasiteter. Men disse enhetene er uegnet for adaptive evolution eksperimenter, som krever en stor celle befolkning med mange mutasjon hendelser 10,11. Nylig, mini-chemostats med arbeidsmengder ~ 10 ml har også blitt utviklet for å fylle gapet mellom liters skala bioreaktorer og microfluidic kjemostat 12,13.
Her presenterer vi utforming og bruk av en lav-kost, automatisert morbidostat for en antibiotika resistens studien. Den foreslåtte Modulen kan anvendes i en rysteinkubator i en mikrobiologisk laboratorium med minimal maskinvare krav. Open-source firmware er også lett tilpasses til spesifikke anvendelser av adaptiv evolusjon, som for eksempel metabolsk ingeniør tre. Til slutt blir morbidostat integrert i en multiplekset mikrofluid plattform for antibiotisk resistenstesting 14.
En lav-fotavtrykk morbidostat enheten fra rimelige komponenter er demonstrert. Økningen i narkotikamotstandsnivå er registrert av enheten er i samsvar med tidligere rapporter 5. Designet for evolusjonære studier av legemiddelresistens, er enheten potensielt gjelder for mange andre eksperimenter. Først kan bli etablert en omfattende database over narkotikainduserte mutasjoner for et stort sett med klinisk relevante antibiotika. For eksempel kan den evolusjonære pathway av multippel legemiddelresistens bli…
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank Prof. Sze-Bi Hsu and Ms. Zhenzhen for useful discussions and help in the theoretical analysis and numerical simulation. Y. T. Y. would like to acknowledge funding support from the Ministry of Science and Technology under grant numbers MOST 103-2220-E-007-026 and MOST 104-2220-E-007-011, and from the National Tsing Hua University under grant numbers 103N2042E1, 104N2042E1, and 105N518CE1.
Environmental Shaker Incubator | BioSan | ES-20 | |
Arduino Leonardo board | Arduino | Leonardo | |
680 Ohm Carbon Resistor | Digikey | Bias resistor for LED | |
100k Ohm Carbon resistor | Digikey | Bias resistor for phototransistor | |
940 nm light emitting diode | Bright LED Electronic | BIR-BM13E4G-2 | Optical density measurement |
940 nm phototransistor | Kodenshi | ST-2L2B | Optical density measurement |
Darlington pair IC Toshiba | Mouser | ULN2803APG | this IC drives micropumps and magnetic stirring unit |
5V DC brushless fan | ADDA | AD0405LX-G70 | spec: 5V supply voltage and 80mA available www.jameco.com |
Piezoelectric micropump | CurieJet | PS15I-FT-5L | Pressure >3kPa Flow rate >5 ml/min |
Tygon 3350 Tuning | Saint Gobain | ABW00001 | ID: 1/32" OD: 3/32" L:50' |
Magnetic Stir bar | COWIE | tapered shape dim: 10 mm x 4mm | |
Glass scintillation 20ml vial | DGS | Pyrex glass 28mm(dia.)x 61 mm(h) | |
Culture vial holder | Custom made from Polyformaldehyde | ||
Silicone | Dow Corning | Sylgald 184 | used to seal the glass vial |
Medium bottle | VWR | 66022-065 | |
Difco M9 minimal salt 5x | BD | Medium | |
Cadamino Acid | BD | Medium | |
glucose | Sigma | ||
Agar Bateriological | Oxoid | for agar plate | |
Luria Bertani medium | |||
Inverted microscope | Leica Microsystems | Leica DMI-LED | used for microfluidic measurement Use X40 objective NA=0.55 |
Microscope Incubator | Live Cell Instrument | CU-109 | used for microfluidic measurement |
Solenoidal valves | Pneumadyne | S10MM-31-12-3 | Normally open 1.3 Watt 12 Vdc |
USB interface card | Hobby Engineering | USBIO24-R Digital I/O Module | for microfluidics measurement |
Air compressor | Rocker Scientific | ROCKER 440 | Pressure source for microfluidcs Max. Pressure 80 Psi |
Male luer-lock fittings to 1/8" barb | ValuePlastics.com | MTLL230-1 | used for microfluidic control |
1/8" barb to 10-32 threaded port | ValuePlastics.com | B-1 | used for microfluidic control |
Female luer-lock fittings to 10-32 threaded port | ValuePlastics.com | KFTL-1 | used for microfluidic control |
NPN darlington transistor 500mA, 40V (2N6427) | DigiKey.com | 2N6427GOS-ND | used for microfluidic control |
10kOhm, carbon film resistor, 0.25W | DigiKey.com | P10KBACT-ND | used for microfluidic control |
Tantalum capacitor, 10uF, 25V, 10% | DigiKey.com | 478-1841-ND | used for microfluidic control |
Andor CCD camera | Andor | Zyla 4.2 Plus SCMOS | used for microfluidic on chip imaging |
ELISA plate reader | |||
two component Silicone | Momentive | RTV 615 | used for microfluidic chip fabrication |
SU-8 photoresist | Micrchem | SU8 2015 | used for microfluidic chip fabrication |
AZ4620 photoresist | Clariant | AZ 4620 | used for microfluidic chip fabrication |
Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC 32G | used for microfluidic chip fabrication |
20 Gauge Syringe Needle | BD | used for microfluidic chip fabrication | |
Labcycler | Sensoquest | Labcycler | PCR |
DNA polymerase | Toyobo | KDO Plus | PCR amplification |
Trimethoprim | Sigma | ||
Plate reader | Biotek | Synergy H1 hybrid | antibiotic resistane measurement |