Cattura e rilascio di vitali circolanti cellule tumorali del sangue

Summary

Un protocollo di utilizzare un poli (N–ISO propylacrylamide) (PIPAAm) microfiltro rivestito per la cattura e il rilascio efficace thermoresponsive delle cellule tumorali circolanti vitali (CTC) è presentato. Questo metodo permette la cattura di CTC dal sangue dei pazienti e il successivo rilascio di valida CTC per la cultura a valle off-chip, analisi e caratterizzazione.

Abstract

Abbiamo dimostrato un metodo per la cattura dimensioni base di vitale cellule tumorali circolanti (CTC) da sangue intero, insieme con il rilascio di queste cellule dal circuito integrato di analisi e / o di cultura downstream. La strategia impiega l'uso di un romanzo Parylene C poro fessura membrana microfiltro per catturare CTC ed un rivestimento di poli (N–ISO propylacrylamide) (PIPAAm) per thermoresponsive rilascio praticabile della CTC catturato. La cattura di cellule vive è abilitata sfruttando la progettazione di una geometria dei pori dello slot con dimensioni specifiche per ridurre la sollecitazione di taglio tipicamente associati con il processo di filtrazione. Mentre il microfiltro presenta una elevata efficienza di cattura, il rilascio di queste cellule non è banale. Tipicamente, solo una piccola percentuale di cellule vengono rilasciati quando si utilizzano tecniche come flusso inverso o raschiatura cellulare. L'adesione di queste cellule tumorali epiteliali alla membrana parylene C è attribuibile alla interazione elettrostatica non specifico. Per contrastare °è effetto, abbiamo impiegato l'uso di rivestimento PIPAAm e sfruttato le sue proprietà interfacciali reattivi termiche per rilasciare le cellule dal filtro. Sangue viene prima filtrato a temperatura ambiente. Sotto 32 ° C, PIPAAm è idrofila. Successivamente, il filtro è posizionato o nel mezzo di coltura o un buffer mantenuta a 37 ° C, che determina la rotazione PIPAAm idrofobica, e successivamente rilasciare le cellule elettrostaticamente rilegati.

Introduction

La malattia metastatica è responsabile per la maggior parte delle morti per cancro. Lo sviluppo di biomarker diagnostici prognostica e compagno di metastasi è cruciale nella gestione e trattamento del cancro. cellule tumorali circolanti (CTC) svolgono un ruolo centrale nella diffusione del tumore e metastasi. Inoltre, essendo facilmente accessibile come una 'biopsia liquida' biomarcatore, CTC nei pazienti affetti da cancro 'sangue periferico è in aumento come un' covo 'per la ricerca sul cancro biomarcatore. CTC sono stati ben convalidato come un biomarcatore prognostico in varie impostazioni di cancro, compresi seno, alla prostata e il cancro colorettale ^1-3. Tuttavia, i recenti progressi nel campo CTC ha indicato che la mera enumerazione di queste rare cellule ha limitato utilità clinica, come dimostrato in studi clinici interventistici ^4. Pertanto, vi è una necessità emergente di tecnologie che consentono la caratterizzazione molecolare e funzionale di CTC. Attualmente, solo alcune tecnologie esistenti che consentono FOR non antigene di parte, la cattura vitale e rilascio di CTC, consentendo robusto valle molecolare e funzionale analisi ^5,6. Maggior parte di questi dispositivi microfabbricati sono accoppiati alle piattaforme microfluidica ed avere quindi un fattore limitante nella quantità di sangue che possono essere trasformati, che varia da 2-4 ml ^{7 – 10.} CTC sono eventi rari in un singolo tubo di prelievo di sangue (7,5 ml), quindi riducendo ulteriormente la quantità di sangue che può essere elaborato, ostacola notevolmente le possibilità di catturare e isolare queste cellule di interesse.

Abbiamo sviluppato due tipi di dispositivi di microfiltri membrana parylene C per la cattura di CTC che sfruttano le differenze di dimensione tra cellule tumorali più grandi e più piccoli normali globuli ^11,12. Abbiamo precedentemente riportato sul filtro pori enumerazione rotonda e lo ha confrontato con una piattaforma approvato dalla FDA, in cui il microfiltro ha dimostrato di essere superiore in CTC efficienza di catturaper i campioni di sangue dei pazienti di cancro ^13,14. Tuttavia, una limitazione del filtro rotondo è la necessità di utilizzare un fissativo a base di formaldeide prima della filtrazione. Questo processo conserva la morfologia delle cellule, consentendo loro di resistere alla sollecitazione di taglio e pressione durante il processo di filtrazione. Mentre enumerazione e studi molecolari possono essere eseguite on-chip ^13, il fissativo compromette la capacità di eseguire la caratterizzazione funzionale. Per far fronte a questa limitazione, abbiamo sviluppato un filtro pori slot che nega la necessità di fissare le cellule prima della filtrazione (Figura 1). La geometria dei pori di slot (6 micron di larghezza x 40 micron di slot lunghezza pori) permette alle cellule tumorali di essere catturati mentre solo parzialmente occlude un poro e quindi ancora permettere il libero passaggio per le altre cellule del sangue e alleviare l'aumento della pressione che porterebbe a danni cellulari ed eventuale scoppio ^15,16 La cartuccia del poro slot è composto da 2 pezzi acrilico che paninoil filtro pori fessura tra la parte superiore e inferiore con Polidimetilsilossano (PDMS) fungente da guarnizione per fornire una perdita sigillo ^14,15 (figura 1).

Mentre l'efficienza di cattura del filtro pori slot è elevata, (Tabella 1), il catturato CTC sono legati alla membrana Parylene C da forti non specifiche interazioni elettrostatiche invece di matrice extracellulare (ECM) adesione ¹⁵ mediata. Metodi come flusso inverso o l'uso di raschietti cellule non riescono a rilasciare efficacemente le cellule dal filtro, o provocare danno cellulare e morte cellulare. Abbiamo esplorato un uso non convenzionale di PIPAAm di formulare una strategia di rilascio ^15. PIPAAm è un polimero che subisce una transizione di fase reversibile temperatura della soluzione critica più bassa (LCST) ad una temperatura della soluzione di 32 ° C ^17. Tradizionalmente, questa proprietà di PIPAAm è stato ampiamente esplorato per applicazioni di ingegneria tissutale. Tipicamente, le cellule sonosuperfici coltivate su PIPAAm rivestito a 37 ° C quando PIPAAm è idrofoba. Le cellule possono quindi essere staccate come un foglio quando la temperatura coltura viene spostata al di sotto 32 ° C, dove la superficie rivestita PIPAAm diventa idratato ^17,18. Abbiamo sfruttato questa proprietà termica eseguendo il processo di filtrazione a temperatura ambiente (inferiore a 32 ° C) e quindi consentire il rilascio delle cellule posizionando il filtro in terreni di coltura mantenuto a 37 ° C. A questa temperatura, lo strato di polimero PIPAAm diventa idrofobo, liberando così il cellule elettrostaticamente legato ¹⁵ (Figura 1).

Sebbene il metodo sensibile alla temperatura, nonché altri metodi sono stati implementati con successo per raggiungere cattura CTC vitali e rilasciare ^{19 – 21,} una chiave potenziale svantaggio condivisa da queste tecnologie riportati è che tutti impiegano un principio antigene-dipendente per la cattura CTC. cattura CTC base di Antigen, come mostrato previously, può portare a parziale CTC analisi ^11,14. Ad esempio, molte tecnologie di affinità basata impiegano anticorpo che si lega EpCAM per la cattura CTC. Tuttavia, CTC ha mostrato di esprimere diversi livelli di EpCAM, portando ad omissione di EpCAM bassa e EpCAM negativo CTC da queste tecnologie. Inoltre, le limitazioni possono verificarsi quando CTC di origine non epiteliale è di interesse, come ad esempio CTC nelle impostazioni di melanoma e sarcoma. Così, una tecnologia che permette di vitale cattura e rilascio CTC senza potenziale distorsione introdotta da antigene-capture based è altamente auspicabile.

È importante sottolineare che il dispositivo di cattura microfiltro è puramente dimensionato in base e la strategia di rilascio è agnostico per la presenza di alcuni marcatori di superficie. Noi crediamo che l'impiego del microfiltro rivestito PIPAAm aiuterà a espandere la nostra comprensione del processo metastatico, fornendo la capacità di catturare e rilasciare CTC per le analisi a valle in modo efficace ed efficiente. Questo può potenteesporre buona resa nuove molecole per le quali nuove terapie mirate sistemiche possono essere diretti, oltre a fornire un biomarker che può essere monitorato in modo semplice e aiuto nel cancro gestione del paziente.

Protocol

Etica Dichiarazione: Per proteggere i diritti dei soggetti umani, i campioni di sangue sono stati ottenuti a seguito di un consenso informato secondo protocolli approvati dalla University of Miami revisione istituzionale tavole sotto IRB 20.150.020. NOTA: Il sangue da filtrare per la cattura CTC deve essere raccolto in un tubo EDTA per prevenire la coagulazione. 1. Rivestimento il microfiltro con Poli (N-iso-propylacrylamide) (PIPAAm) Pesare PIPAAm preparare un 10% w / v in butanolo. Mescolare …

Representative Results

Utilizzando il sangue donatori sani '(ottenuto con un protocollo approvato dalla University of Miami IRB 20.150.020 a seguito di un consenso informato) a spillo con le cellule tumorali in coltura, la tecnica thermoresponsive per il rilascio di cellule vitali circolanti tumorali (CTC), la cattura raggiunto, il rilascio e l'efficienza di recupero del 94% ± 9%, 82% ± 5% e 77% ± 5% rispettivamente (Tabella 1) 15. In confronto, l'efficienza rilascio …

Discussion

Il processo di acquisizione vitali CTC dal sangue intero e rilascio dal microfiltro è relativamente semplice; tuttavia alcuni punti critici sono degni di nota. È indispensabile, come tutte coltura cellulare che una condizione sterile viene mantenuta attraverso l'intero processo. La fase iniziale del rivestimento del filtro con PIPAAm è critica, come base per la tecnica di rilasciare le cellule dal filtro si basa sullo sfruttamento di temperatura reattivi proprietà interfacciali del PIPAAm. Per assicurare il filt…

Materials

Slot Filter	Circulogix Inc.	MSF-01	Different size filters available based for filtration for CTC from blood or urine (www.circulogixinc.com)
poly(N-iso-propylacrylamide) (PIPAAm)	Ploysciences Inc.	21458	Non-Hazardous. Store at room temp.
1-Butanol	Sigma Aldrich	B7906	Use in well ventilated area
Plastic Microscope Slides	Cole-Parmer	48510-30	Any plastic slides or alternatively any sort of square (Metal, Acrylic etc.) can be used if it will be bale to hold the 8mmx8mm filter square
Spin Coater	Specialty Coating Systems	SCS G3 Spin Coater	Instrument
Polyimide Tape	Uline	S-7595	Polyimide is the generic name for Kapton Tape which can be purchased form multiple vendors (Amazon, Kaptontape.com)
HBSS- Hank's Balanced Salt Solution	Gibco	14025-092
1XPBS	Gibco	10010-023
McCoy's	Gibco	16600-082	Warm in 37 ⁰C water bath before use. McCoys was used for SKBr3 cells, if you use different cell lines or patient blood, please use media that would be optimal for that particular case
Falcon Petri dishes 35×10 mm	VWR	25373-041
Microfilter Cassette	Circulogix Inc.	FC-01	Custom catridges are avilable based on filtration for CTC from blood or urine
Syringe 20mL	BD Scientific	302830
Syringe Pump	KD scientific	78-0100V	Any syringe pump capable of holding a 25mL syringe may be used
Cellstar 50mL Centrifuge tube	VWR	82050-322
Greiner Bio One 6 well plate	VWR	89131-688	Any brand can be used, as long as the surface is compatiable for cell adesion and not repellant
SKBR3 Cells	ATCC	HTB-30
Live Dead Assay	Life Technologies	L3224	Any assay that can provide a reasonable analysis to evaluate live cells will work
Cell Culture Incubator	VWR	98000-368	Any incubator that can be used for cell culture will suffice