キャプチャと血液から生存循環腫瘍細胞のリリース
Summary
プロトコルは、ポリ（N -iso-プロピル）効果的な捕獲、生存循環腫瘍細胞（CTC）の熱応答性放出のための（PIPAAm）コーティングされたマイクロフィルター提示さを利用します。この方法は、患者の血液と下流オフチップの文化のための実行可能なCTCの今後のリリースからのCTCの捕獲を可能に分析し、特性評価。
Abstract
私たちは、下流の分析および/または培養のためのチップからのこれらの細胞のリリースに伴い、全血から実行可能な循環腫瘍細胞（CTC）のサイズベースの捕獲のための方法を示しています。戦略は、CTCと撮影しCTCの熱応答性実行可能なリリースのためのポリコーティング（N -ISO-プロピル）（PIPAAm）を取得するための新規なパリレンC膜のスロット孔のマイクロフィルターの使用を採用します。生きた細胞の捕獲は、典型的には、濾過プロセスに関連付けられたせん断応力を低減するために、特定の寸法を有するスロット細孔形状の設計を活用することで有効になっています。マイクロフィルターは、高い捕集効率を示すが、これらの細胞の放出は非自明です。そのような逆流または細胞掻爬などの技術が使用される場合、典型的には、細胞のわずかな割合が放出されます。パリレンC膜へのこれらの上皮癌細胞の強力な接着は、非特異的静電相互作用に起因します。目に対抗します効果がある、我々はPIPAAmのコーティングの使用を採用し、フィルターから細胞を解放するためにその熱応答性の界面特性を利用しました。血液は、最初に室温で濾過します。 32°C以下、PIPAAmは親水性です。その後、フィルターを培地またはPIPAAm旋回疎水性になる37℃に維持バッファのいずれかに配置され、続いて静電的に結合した細胞を放出します。
Introduction
転移性疾患は、ほとんどの癌死亡の原因です。転移するための予後とコンパニオン診断バイオマーカーを開発することは、がんの管理と治療に重要です。循環腫瘍細胞（CTC）は、腫瘍の播種および転移において中心的な役割を果たしています。また、「液体生検」のバイオマーカーとして簡単にアクセス可能で、CTCは、癌患者における癌バイオマーカー研究のための温床 ''末梢血のように上昇しています」。 3 – CTCはよく乳癌、前立腺癌および結腸直腸癌1を含む様々な癌の設定、で予後バイオマーカーとして検証されています。しかし、CTCの分野における最近の進歩は、介入臨床試験4に示すように、これらの希少細胞の単なる列挙は、臨床的有用性を制限していることが示されました。このように、CTCの分子および機能的特徴付けを可能にする技術の新興必要性があります。現在、わずか数技術がfoを可能にする存在しますrの非抗原バイアスされ、実行可能な捕捉およびCTCのリリース、堅牢な下流の分子と機能解析の5,6を可能にします。これらの微細加工装置の大半は、マイクロ流体プラットフォームに結合され、したがって、2〜4ミリリットル7の範囲であることを処理することができる血液の量、の制限要因持っている– 10。 CTCが大幅捕捉および目的のこれらの細胞を単離する可能性を妨げ、従って、さらに処理することができる血液の量を減少させる、採血（7.5 ml）を単一チューブで珍しい事象です。
我々は、より大きな腫瘍細胞およびより小さい正常な血液細胞11,12の間のサイズの違いを利用するCTCの捕獲のためのパリレンC膜マイクロデバイスの2種類を開発しました。我々は以前のラウンド細孔列挙フィルタに報告し、マイクロフィルタは、CTCの捕獲効率が優れていることが示されたFDA承認プラットフォームとそれを比較しました癌の患者の血液サンプル13,14。しかし、円形フィルタの制限は、濾過前に、ホルムアルデヒドベースの固定剤を使用する必要があります。このプロセスは、それらが濾過プロセスの間にせん断応力と圧力に耐えることができるようにしながら、細胞の形態を保持します。列挙及び分子的研究は、オンチップ13を行うことができるが、固定は、機能的特徴付けを実行する能力を損ないます。この制限に対処するために、我々は、濾過前（ 図1）に細胞を固定するための必要性を否定するスロット孔のフィルターを開発しました。スロット孔形状（6ミクロン幅×40μmの長スロット孔）部分的にしか細孔を閉塞するので、さらに他の血液細胞のための自由な通過を可能にし、細胞の損傷につながる圧力の上昇を緩和しながら、腫瘍細胞が捕捉することを可能にしますそして最終的に破裂15,16は、スロット孔のカートリッジはサンドイッチ2アクリル片で構成されています漏れ防止シール14,15（ 図1）を提供するために、ガスケットとしてポリジメチルシロキサン（PDMS）の演技でトップとボトムピース間のスロット孔フィルター。
スロット孔フィルタの捕捉効率が高いが、（ 表1）、捕捉CTC代わりに接着15を媒介し 、細胞外マトリックス（ECM）の強い非特異的静電相互作用によって、パリレンC膜に結合されています。そのような逆流または細胞スクレーパーを使用するなどの方法が効果的にフィルターから細胞を放出し、または細胞損傷および細胞死をもたらすことができません。私たちは、リリース戦略15を策定するPIPAAmの型破りな使用を検討しました。 PIPAAmは可逆下限臨界溶液温度（LCST）32°C 17の溶液温度で相転移を受けるポリマーです。伝統的に、PIPAAmのこの特性は、広く組織工学アプリケーションのために検討されています。典型的には、細胞でありますPIPAAmが疎水性である場合、37°CでPIPAAm被覆された表面上で培養しました。培養温度は、PIPAAm被覆された表面が水和17,18なる32°C以下に移行するときに、細胞は、次にシートとして取り外すことができます。我々は、（32℃未満）を室温で濾過処理を行い、その後37℃で維持培地にフィルタを配置することによって、細胞の放出を可能にすることによって、この熱的性質を利用しました。この温度で、PIPAAmのポリマー層は、それによって静電結合した細胞15（ 図1）を解放し、疎水性になります。
温度応答方法だけでなく、他の方法が成功し19キャプチャおよびリリースの実行可能なCTCを達成するために実装されているが– 21を 、報告されたこれらの技術によって共有される1つのキーの潜在的な欠点は、それらすべては、CTCの捕獲のための抗原依存性の原則を採用することです。抗原ベースのCTC捕獲、示すように、previously、バイアスされたCTC分析11,14につながる可能性があります。例えば、多くの親和性に基づく技術は、CTCの捕獲のためのEpCAMに特異的に結合する抗体を使用します。ただし、CTCは、これらの技術によってEpCAMの低EpCAMの負CTCの漏れにつながるのEpCAMの様々なレベルを発現することが示されています。非上皮起源からCTCは黒色腫および肉腫の設定で、このようなCTCとして、関心がある場合にも、制限が発生することがあります。したがって、抗原ベースのキャプチャーによって導入された潜在的なバイアスなしで実行可能なCTCの捕獲および放出を可能にする技術が非常に望ましいです。
重要なことは、マイクロキャプチャ装置は、純粋に基づく大きさと解放戦略は、特定の表面マーカーの存在に依存しないです。私たちは、PIPAAm被覆したマイクロフィルターの雇用が効果的かつ効率的に捕捉し、下流の分析のためにCTCを放出する能力を提供することを通じて、転移過程の理解を広げるのに役立つと確信しています。これは強力かもしれませんially小説は全身療法が向けだけでなく、容易に監視することができるバイオマーカーを提供し、がん患者管理に役立つ可能性があります対象とするための新たな分子を公開します。
Protocol
Representative Results
Discussion
全血から生存CTCを捕捉し、マイクロフィルターからそれらを解放するプロセスは比較的簡単です。しかし、いくつかの重要なポイントは、言及する価値があります。これは、滅菌状態がプロセス全体を通じて維持されているすべての細胞培養と同様に、必須です。フィルタから細胞を放出させる技術の基礎は、PIPAAmの温度応答性界面特性を利用することに基づいているようPIPAAmでフィルタを?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank all the patients who have donated blood samples to support this work. We thank Drs. Guiseppe Giaconne, Ritesh Parajuli, and Marc E. Lippman for their assistance in clinical sample acquirement, and Drs. Carmen Gomez, Ralf Landgraf, Stephan Züchner, Toumy Guettouche, Diana Lopez for their insightful discussions. Zheng Ao thanks partial support and assistance from the Sheila and David Fuente Graduate Program in Cancer Biology, Sylvester Comprehensive Cancer Center.
Materials
| Slot Filter | Circulogix Inc. | MSF-01 | Different size filters available based for filtration for CTC from blood or urine (www.circulogixinc.com) |
| poly(N-iso-propylacrylamide) (PIPAAm) | Ploysciences Inc. | 21458 | Non-Hazardous. Store at room temp. |
| 1-Butanol | Sigma Aldrich | B7906 | Use in well ventilated area |
| Plastic Microscope Slides | Cole-Parmer | 48510-30 | Any plastic slides or alternatively any sort of square (Metal, Acrylic etc.) can be used if it will be bale to hold the 8mmx8mm filter square |
| Spin Coater | Specialty Coating Systems | SCS G3 Spin Coater | Instrument |
| Polyimide Tape | Uline | S-7595 | Polyimide is the generic name for Kapton Tape which can be purchased form multiple vendors (Amazon, Kaptontape.com) |
| HBSS- Hank's Balanced Salt Solution | Gibco | 14025-092 | |
| 1XPBS | Gibco | 10010-023 | |
| McCoy's | Gibco | 16600-082 | Warm in 37 ⁰C water bath before use. McCoys was used for SKBr3 cells, if you use different cell lines or patient blood, please use media that would be optimal for that particular case |
| Falcon Petri dishes 35×10 mm | VWR | 25373-041 | |
| Microfilter Cassette | Circulogix Inc. | FC-01 | Custom catridges are avilable based on filtration for CTC from blood or urine |
| Syringe 20mL | BD Scientific | 302830 | |
| Syringe Pump | KD scientific | 78-0100V | Any syringe pump capable of holding a 25mL syringe may be used |
| Cellstar 50mL Centrifuge tube | VWR | 82050-322 | |
| Greiner Bio One 6 well plate | VWR | 89131-688 | Any brand can be used, as long as the surface is compatiable for cell adesion and not repellant |
| SKBR3 Cells | ATCC | HTB-30 | |
| Live Dead Assay | Life Technologies | L3224 | Any assay that can provide a reasonable analysis to evaluate live cells will work |
| Cell Culture Incubator | VWR | 98000-368 | Any incubator that can be used for cell culture will suffice |
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