캡처 및 혈액에서 실행 가능한 순환 종양 세포의 릴리스
Summary
프로토콜은 폴리 (N -iso – 프로필 아크릴) 효과적인 캡처 및 가능한 순환 종양 세포 (CTC)의 thermoresponsive 릴리스 (PIPAAm) 코팅 된 마이크로 제시를 활용합니다. 이 방법은 분석 및 특성, 하류 오프 – 칩 문화에 대한 환자의 혈액과 가능한 CTC의 후속 릴리스에서 CTC를 캡처 할 수 있습니다.
Abstract
우리는 다운 스트림 분석 및 / 또는 문화 칩에서 이러한 세포의 출시와 함께, 전체 혈액에서 가능한 순환 종양 세포 (CTC)의 크기를 기반으로 캡처하는 방법을 보여줍니다. 전략은 CTC CTC 및 캡처의 thermoresponsive 가능한 릴리스 코팅 폴리 (N–iso 프로필 아크릴) (PIPAAm)를 캡처하는 신규 파릴 렌 C 막 슬롯 마이크로 기공의 사용을 이용한다. 생균의 촬영은 일반적으로 여과 공정과 관련된 전단 응력을 줄이기 위해 특정 치수를 갖는 슬롯이 기공 구조의 설계를 활용하여 사용할 수있다. 마이크로 필터는 높은 포집 효율을 나타내는 반면,이 세포의 방출이 아닌 사소한입니다. 이러한 역류 또는 세포 스크랩과 같은 기술을 사용하는 경우 일반적으로 세포의 작은 비율은 해제된다. 파릴 렌 C 막 이러한 상피 암세포의 강한 접착력 비특이적 정전 기적 상호 작용에 기인한다. 일을 방해하기효과 우리 PIPAAm 코팅의 사용을 사용하여 필터로부터 세포를 분리하는 열적 반응 형 계면 성질을 이용. 혈액 제 실온에서 여과 하였다. 32 ° C 아래 PIPAAm는 친수성이다. 그 후, 필터는 배양 배지 또는 소수성을 회전시키고,이어서 세포 정전기 결합 해제 PIPAAm 결과 37 ° C로 유지 된 버퍼 하나에 배치된다.
Introduction
전이성 질환은 대부분의 암 사망에 대한 책임이 있습니다. 전이에 대한 예후 및 동반자 진단 바이오 마커의 개발은 암 관리 및 치료에 매우 중요하다. 순환 성 종양 세포 (CTC)를 보급 종양 및 전이에 중요한 역할을 담당한다. 또한, '액체 생검'바이오 마커로 쉽게 접근 할 수있는, 암 환자에서 CTC 암 바이오 마커 연구를위한 온상 ''말초 혈액은으로 증가하고있다 '. 3 – CTC 잘 유방암, 전립선 암과 대장 암 1 등 다양한 암 설정에서 예후 바이오 마커로 확인되었다. 그러나, CTC 분야에서 최근의 발전은 중재 임상 4에 도시 된 바와 같이, 이러한 희귀 세포의 단순한 열거, 임상 적 유용성을 제한 것을 지시 하였다. 따라서, CTC의 분자 및 기능 특성 수 있도록 기술에 대한 신흥 필요가있다. 현재, 몇 가지 기술은 fo를 허용하는 존재R 비 항원 바이어스, 가능한 캡처 및 CTC의 방출, 강력한 다운 스트림 분자 및 기능 분석 5,6을 가능하게한다. 이러한 미세 소자의 대부분은 마이크로 유체 플랫폼에 결합되고, 따라서 2-4 ml의 7 내지 그 처리 할 수있는 혈액의 양에 제한 요소가있다 – 10. CTC 크게 캡처 관심이 세포 분리의 가능성을 방해하므로 상기 피 처리 수의 양을 줄일 채혈 (7.5 ㎖)의 단일 튜브 희귀 이벤트이다.
우리는 더 큰 종양 세포와 작은 정상 혈구 세포 (11, 12) 사이의 크기 차이를 이용 CTC의 캡처 파릴 렌 C 막 마이크로 디바이스의 두 가지 유형을 개발 하였다. 우리는 이전에 둥근 구멍 열거 필터보고 및 마이크로은 CTC 포착 효율이 우수한 것으로 도시 된 FDA 승인 플랫폼과 비교 한암 환자의 혈액 샘플 13, 14합니다. 다만, 원형 필터의 한계를 여과 전에 포름 알데히드 계 고정 제를 사용할 필요가있다. 이 프로세스는이를 여과 과정 전단 응력 및 압력을 견딜 수 있도록하면서 세포 형태를 보존한다. 열거 분자 연구가 온 – 칩 (13)을 수행 할 수 있지만, 정착액 기능적 특성화를 수행하는 능력을 손상시킨다. 이러한 한계를 해결하기 위해 여과 전에 셀 (도 1)를 고정 할 필요성을 부정 슬롯 기공 필터를 개발했다. 슬롯 구멍 형상 (6 μm의 폭 × 40 μm의 길이 슬롯 구멍)은 단지 부분적으로 또 다른 혈액 세포 자유로운 통과를 허용하고 세포 손상을 초래할 것이다 압력 상승을 완화 따라서 세공 폐색하면서, 종양 세포를 포착 할 수 있도록 및 최종 버스트 15,16 슬롯 기공 카트리지는 샌드위치 2 아크릴 조각으로 구성된다개스킷 등의 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 작용과 상부 및 하부 부분들 사이의 슬롯 기공 필터는 누수 방지 시일 (14, 15) (도 1)를 제공한다.
슬롯 구멍 필터의 포집 효율이 높은 반면, (표 1), 촬상 CTC 대신 접착 15 매개 된 세포 외 기질 (ECM)의 강한 비특이적 정전 기적 상호 작용에 의해 파릴 렌 C 막에 결합된다. 이러한 역류 또는 세포 스크레이퍼를 사용하는 등의 방법 효과적으로 필터에서 세포를 분리, 또는 세포 손상 및 세포 사망을 초래할 실패합니다. 우리는 릴리스 전략 (15)을 수립하는 PIPAAm의 자유로운 사용을 탐험했다. PIPAAm 32 °의 용액 온도 17 C 가역적 낮은 임계 용액 온도 (LCST) 상전이 중합체이다. 전통적으로, PIPAAm의이 속성을 널리 조직 공학 응용 프로그램에 대해 탐구하고있다. 일반적으로 세포는PIPAAm에서 배양 PIPAAm은 소수성 인 경우 37 ℃에서 표면을 코팅. 배양 온도는 PIPAAm 코팅면 (17, 18)이된다 수화 32 ° C, 아래로 시프트 될 때 세포를 시트로 분리 될 수있다. 우리는 실온 (아래 32 ° C)에서 여과 공정을 수행 한 후 37 ° C로 유지 배지에 필터를 배치하여 세포 분리를 가능하게함으로써 열 특성을 이용. 이 온도에서, PIPAAm 중합체 층함으로써 정전 결합 된 셀 (15) (도 1)를 개방, 소수성이된다.
온도 감응 방법뿐만 아니라 다른 방법들이 성공적 19 생존 CTC 캡처를 달성하고 방출하도록 구현하였으나 -보고 된 이러한 기술이 공유 21 번 키 잠재적 인 결점들은 모두 CTC 캡쳐 항원 – 의존적 원리를 채용한다는 것이다. 항원 기반 CTC 캡처, 그림과 같이 페이지reviously, 바이어스 CTC 분석 11,14 발생할 수 있습니다. 예를 들어, 많은 선호도 기반 기술은 CTC 캡쳐는 EpCAM 결합 된 항체를 사용한다. 그러나, CTC는 이러한 기술로는 EpCAM 저와는 EpCAM 부정적인 CTC의 누락에지도는 EpCAM의 다양한 수준을 표현하는 것으로 나타났다. 비 상피 기원에서 CTC는 흑색 종 및 육종 설정에서 같은 CTC 같은 관심의 경우 또한 제한이 발생할 수 있습니다. 따라서, 항원 기반 캡처에 의해 도입 된 잠재적 인 편견없이 실행 가능한 CTC 캡처 및 출시 할 수있는 기술은 매우 바람직하다.
중요하게는, 마이크로 캡쳐 디바이스는 순수 기초 크기 및 분리 전략은 특정 표면 마커의 존재에 무관하다. 우리는 PIPAAm 코팅 된 마이크로의 고용 효과적이고 효율적으로 캡처 및 다운 스트림 분석을 위해 CTC를 해제 할 수있는 기능을 제공함으로써, 전이성 과정에 대한 우리의 이해를 확장하는 데 도움이 될 것입니다 믿습니다. 강력한이 5 월ially 쉽게 모니터링하고 암 환자 관리에 도움 될 수있는 바이오 마커를 제공하기 때문에 새로운 타겟 전신 치료가 아니라 감독 할 수있는 새로운 분자를 노출합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
전혈에서 가능한 CTC 캡처 및 마이크로 그들을 해제 과정은 비교적 간단하다; 그러나 몇 가지 중요한 점은 언급 할 가치가있다. 이 멸균 상태가 전체 프로세스를 통해 유지되는 모든 세포 배양과 마찬가지로 필수적이다. 필터로부터 세포를 해제하는 방법의 기초가 PIPAAm의 온도 감응 계면 성질을 이용을 기반으로 PIPAAm으로 필터를 코팅의 초기 단계는 매우 중요하다. 필터는 효과적으로 피복되어 있…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank all the patients who have donated blood samples to support this work. We thank Drs. Guiseppe Giaconne, Ritesh Parajuli, and Marc E. Lippman for their assistance in clinical sample acquirement, and Drs. Carmen Gomez, Ralf Landgraf, Stephan Züchner, Toumy Guettouche, Diana Lopez for their insightful discussions. Zheng Ao thanks partial support and assistance from the Sheila and David Fuente Graduate Program in Cancer Biology, Sylvester Comprehensive Cancer Center.
Materials
| Slot Filter | Circulogix Inc. | MSF-01 | Different size filters available based for filtration for CTC from blood or urine (www.circulogixinc.com) |
| poly(N-iso-propylacrylamide) (PIPAAm) | Ploysciences Inc. | 21458 | Non-Hazardous. Store at room temp. |
| 1-Butanol | Sigma Aldrich | B7906 | Use in well ventilated area |
| Plastic Microscope Slides | Cole-Parmer | 48510-30 | Any plastic slides or alternatively any sort of square (Metal, Acrylic etc.) can be used if it will be bale to hold the 8mmx8mm filter square |
| Spin Coater | Specialty Coating Systems | SCS G3 Spin Coater | Instrument |
| Polyimide Tape | Uline | S-7595 | Polyimide is the generic name for Kapton Tape which can be purchased form multiple vendors (Amazon, Kaptontape.com) |
| HBSS- Hank's Balanced Salt Solution | Gibco | 14025-092 | |
| 1XPBS | Gibco | 10010-023 | |
| McCoy's | Gibco | 16600-082 | Warm in 37 ⁰C water bath before use. McCoys was used for SKBr3 cells, if you use different cell lines or patient blood, please use media that would be optimal for that particular case |
| Falcon Petri dishes 35×10 mm | VWR | 25373-041 | |
| Microfilter Cassette | Circulogix Inc. | FC-01 | Custom catridges are avilable based on filtration for CTC from blood or urine |
| Syringe 20mL | BD Scientific | 302830 | |
| Syringe Pump | KD scientific | 78-0100V | Any syringe pump capable of holding a 25mL syringe may be used |
| Cellstar 50mL Centrifuge tube | VWR | 82050-322 | |
| Greiner Bio One 6 well plate | VWR | 89131-688 | Any brand can be used, as long as the surface is compatiable for cell adesion and not repellant |
| SKBR3 Cells | ATCC | HTB-30 | |
| Live Dead Assay | Life Technologies | L3224 | Any assay that can provide a reasonable analysis to evaluate live cells will work |
| Cell Culture Incubator | VWR | 98000-368 | Any incubator that can be used for cell culture will suffice |
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