Fånga och Release av livsdugliga cirkulerande tumörceller från blod

Summary

Ett protokoll för att använda en poly (N -iso-propylakrylamid) (PIPAAm) belagd mikro för effektiv infångning och termoresponsiv frisättning av livsdugliga cirkulerande tumörceller (CTC) presenteras. Denna metod tillåter fångst av CTC från patienternas blod och efterföljande frisättning av livskraftig CTC för nedströms utanför chipset kultur, analyser och karakterisering.

Abstract

Vi visar en metod för storleksbaserad infångning av livsdugliga cirkulerande tumörcell (CTC) från helblod, tillsammans med frisättningen av dessa celler från chip för analys och / eller kultur nedströms. Strategin utnyttjar användning av en ny Parylen C membran slot pore mikrofilter för att fånga CTC och en beläggning av poly (N -iso-propylakrylamid) (PIPAAm) för termoresponsiv livskraftig frisättning av det infångade CTC. Infångandet av levande celler har aktiverats genom att utnyttja utformningen av en slits porgeometrin med specifika dimensioner för att minska skjuvspänningen vanligtvis förknippas med filtreringsprocessen. Medan mikrofiltret uppvisar en hög infångningseffektivitet, är frisättningen av dessa celler icke-trivial. Normalt är endast en liten andel av celler frigörs när tekniker såsom omvänt flöde eller cell skrapning används. Den starka vidhäftningen av dessa epitelceller cancerceller till Parylen C membranet är hänförlig till icke-specifik elektrostatisk växelverkan. Att motverka thär effekt, använde vi användning av PIPAAm beläggning och utnyttjade sina termiska känsliga gräns egenskaper att frigöra cellerna från filtret. Blod filtreras först i rumstemperatur. Under 32 ° C, är PIPAAm hydrofil. Därefter filtret placeras i antingen odlingsmedia eller en buffert som hölls vid 37 ° C, vilket resulterar i att PIPAAm vrida hydrofoba, och därefter frigöra elektrostatiskt bundna celler.

Introduction

Metastatisk sjukdom är ansvarig för de flesta dödsfall i cancer. Utveckla prognostiska och följeslagare diagnostisk biomarkör för metastaser är avgörande för cancervården och behandling. Cirkulerande tumörceller (CTC) spelar en central roll i tumörspridning och metastas. Dessutom är lättillgänglig som en "flytande biopsi" biomarkör, CTC hos cancerpatienter "har perifert blod ökat som en" grogrund "för cancer biomarkör forskning. CTC har väl validerade som en prognostisk biomarkör i olika miljöer cancer, inklusive bröst-, prostata- och tjocktarmscancer ^1-3. Emellertid har de senaste framstegen inom CTC fält visade att ren uppräkning av dessa sällsynta celler har begränsad klinisk användbarhet, såsom visas i interventionella kliniska försök ^4. Således finns det ett växande behov av tekniker som gör det möjligt för molekylär och funktionell karakterisering av CTC. För närvarande finns det endast ett fåtal tekniker som gör det möjligt for icke-antigen partisk, livskraftig infångning och frisättning av CTC, som möjliggör robust nedströms molekylär och funktionell analys ^5,6. Majoriteten av dessa mikrofabricerade enheter är kopplade till mikroflödes plattformar och därmed ha en begränsande faktor i mängden blod som kan behandlas, som sträcker sig från 2-4 ml ^7-10. CTC är sällsynta händelser i ett enda rör av blod draw (7,5 ml), således ytterligare minskar mängden blod som kan behandlas, avsevärt hindrar chanserna att fånga och isolering av dessa celler av intresse.

Vi har utvecklat två typer av Parylen C membranmikrofilteranordningar för fångst av CTC som utnyttjar storleksskillnader mellan större tumörceller och de mindre normala blodceller ^11,12. Vi har tidigare rapporterat om den runda porer uppräkning filter och jämförde det med en FDA-godkända plattform, där mikro visade sig vara överlägsen i CTC infångningseffektivitetenför cancerpatient blodprov ^13,14. Emellertid är en begränsning av den runda filtret nödvändigheten av att använda ett formaldehydbaserat fixativ före filtrering. Denna process bevarar cellerna morfologi samtidigt som de motstå skjuvspänningen och tryck under filtreringsprocessen. Medan uppräkning och molekylära studier kan utföras on-chip ^13, försämrar fixativet förmågan att utföra funktionell karakterisering. Att ta itu med denna begränsning, har vi utvecklat en slits porfilter som negerar nödvändigheten att fixera celler före filtrering (figur 1). Spåret porgeometrin (6 um bredd x 40 pm längd slot porer) gör att tumörcellerna fångas medan endast delvis täppa en por och därmed fortfarande tillåter fri passage för andra blodkroppar och lindra tryckökningen som skulle leda till cellskador och eventuell sprängning ^15,16 Slits por patron består av 2 stycken som smörgås akrylslitsen porfilter mellan topp- och bottenstycket med Polydimetylsiloxan (PDMS) tjäna som en packning för att åstadkomma en läcksäker tätning ^14,15 (Figur 1).

Medan uppsamlingskapacitet av slitsen porfilter är hög, är (tabell 1), den fångade CTC bunden till Parylen C membranet genom starka icke-specifika elektrostatiska interaktioner i stället för extracellulära matrisen (ECM) medierad adhesion ^15. Metoder såsom omvänd flöde eller användning av cellskrapor misslyckas med att effektivt frigöra cellerna från filtret, eller resultera i cellskada och celldöd. Vi utforskade en okonventionell användning av PIPAAm att formulera en strategi för att frigöra ^15. PIPAAm är en polymer som undergår en reversibel lägre kritisk lösningstemperatur (LCST) fasomvandling vid en lösningstemperatur av 32 ° C ^17. Traditionellt har denna egenskap hos PIPAAm varit allmänt utforskas för vävnadstekniska tillämpningar. Typiskt är cellernaodlades på PIPAAm belagda ytor vid 37 ° C när PIPAAm är hydrofob. Cellerna kan sedan lösgöras som ett ark när odlingstemperaturen skiftas till under 32 ° C, där PIPAAm belagda ytan blir hydratiserad ^17,18. Vi utnyttjade denna termiska egenskapen genom att utföra filtreringsprocessen vid rumstemperatur (under 32 ° C) och därefter möjliggöra cellfrisättning genom att placera filtret i odlingsmedier som hölls vid 37 ° C. Vid denna temperatur blir PIPAAm polymerskiktet hydrofobt, för att därigenom frigöra det elektrostatiskt bundna celler ¹⁵ (figur 1).

Även den temperaturkänsliga metod liksom andra metoder har framgångsrikt genomförts för att uppnå livskraftig CTC fånga och släpp ^19-21, en nyckel potentiell nackdel som delas av dessa tekniker som rapporterats är att de alla använder en antigen-beroende princip för CTC fånga. Antigenbaserade CTC fånga, som visas pidigare, kan leda till partiska CTC analys ^11,14. Till exempel har många affinitetsbaserade tekniker använder antikropp som binder EpCAM för CTC fånga. Emellertid har CTC visats uttrycka olika nivåer av EpCAM, vilket leder till utelämnandet av EpCAM låg och EpCAM negativ CTC genom denna teknik. Dessutom kan begränsningar uppstå när CTC från icke-epitelial ursprung är av intresse, såsom CTC i melanom och sarkom inställningar. Således, är mycket önskvärt en teknik som gör det möjligt för livskraftig CTC infångning och frisättning utan eventuell bias infördes genom antigenbaserade fånga.

Viktigare, är mikrofiltret infångningsanordningen rent dimensionerad baserat och släppstrategi är agnostic på närvaron av vissa ytmarkörer. Vi tror att anställning av PIPAAm belagda mikro kommer att bidra till vår förståelse av metastatisk process, genom att tillhandahålla möjligheten att på ett effektivt sätt fånga och släpp CTC för analyser nedströms. Detta kan potentaially exponera nya molekyler som nya riktade systemiska behandlingar kan riktas samt ge en biomarkör som kan övervakas enkelt och stöd i cancer patienthantering.

Protocol

Etik uttalande: För att skydda rättigheterna för försökspersoner togs blodprover efter ett informerat samtycke enligt protokoll som godkänts av University of Miami institutionella prövningsnämnder enligt IRB 20.150.020. OBS: Blod filtreras för CTC fånga bör samlas i ett EDTA-rör för att förhindra koagulering. 1. Beläggning av mikrofilter med Poly (N-iso-propylakrylamid) (PIPAAm) Väg upp PIPAAm för framställning av en 10% vikt / volym lösning i butanol. Blanda med hjälp av en…

Representative Results

Med friska donatorer blod (som erhållits enligt ett protokoll som godkänts av University of Miami IRB 20.150.020 efter ett informerat samtycke) spetsad med odlade cancerceller, den termoresponsiva teknik för frisläppande av livsdugliga cirkulerande tumörceller (CTC), uppnådde infångning, utsättningen och hämtning effektivitet av 94% ± 9%, 82% ± 5% och 77% ± 5% (tabell 1) 15. Som jämförelse, var frisättningen och hämtning effektivitet obelagda f…

Discussion

Processen att fånga livskraftig CTC från helblod och frigöra dem från mikro är relativt enkelt; men några kritiska punkter är värda att nämna. Det är absolut nödvändigt, som vid all cellkultur som ett sterilt tillstånd upprätthålls genom hela processen. Det initiala steget att belägga filtret med PIPAAm är kritisk, som grund för den teknik för att frigöra cellerna från filtret baseras på att utnyttja PIPAAm s temperaturkänsliga gränsegenskaper. För att säkerställa att filtret har belagts effek…

Materials

Slot Filter	Circulogix Inc.	MSF-01	Different size filters available based for filtration for CTC from blood or urine (www.circulogixinc.com)
poly(N-iso-propylacrylamide) (PIPAAm)	Ploysciences Inc.	21458	Non-Hazardous. Store at room temp.
1-Butanol	Sigma Aldrich	B7906	Use in well ventilated area
Plastic Microscope Slides	Cole-Parmer	48510-30	Any plastic slides or alternatively any sort of square (Metal, Acrylic etc.) can be used if it will be bale to hold the 8mmx8mm filter square
Spin Coater	Specialty Coating Systems	SCS G3 Spin Coater	Instrument
Polyimide Tape	Uline	S-7595	Polyimide is the generic name for Kapton Tape which can be purchased form multiple vendors (Amazon, Kaptontape.com)
HBSS- Hank's Balanced Salt Solution	Gibco	14025-092
1XPBS	Gibco	10010-023
McCoy's	Gibco	16600-082	Warm in 37 ⁰C water bath before use. McCoys was used for SKBr3 cells, if you use different cell lines or patient blood, please use media that would be optimal for that particular case
Falcon Petri dishes 35×10 mm	VWR	25373-041
Microfilter Cassette	Circulogix Inc.	FC-01	Custom catridges are avilable based on filtration for CTC from blood or urine
Syringe 20mL	BD Scientific	302830
Syringe Pump	KD scientific	78-0100V	Any syringe pump capable of holding a 25mL syringe may be used
Cellstar 50mL Centrifuge tube	VWR	82050-322
Greiner Bio One 6 well plate	VWR	89131-688	Any brand can be used, as long as the surface is compatiable for cell adesion and not repellant
SKBR3 Cells	ATCC	HTB-30
Live Dead Assay	Life Technologies	L3224	Any assay that can provide a reasonable analysis to evaluate live cells will work
Cell Culture Incubator	VWR	98000-368	Any incubator that can be used for cell culture will suffice