نمو المؤجل تثبيط الفحص لتحديد تأثير مضادات الميكروبات المستمدة البكتيريا على المنافسة
Summary
The deferred growth inhibition assay can be used to assess the competition effect by one bacterial isolate on another. Inhibition is quantified by measuring the zone of clearing around the inhibitor-producing isolate, or qualitatively assessed by determining the visible extent of inhibition.
Abstract
Competitive exclusion can occur in microbial communities when, for example, an inhibitor-producing strain outcompetes its competitor for an essential nutrient or produces antimicrobial compounds that its competitor is not resistant to. Here we describe a deferred growth inhibition assay, a method for assessing the ability of one bacterium to inhibit the growth of another through the production of antimicrobial compounds or through competition for nutrients. This technique has been used to investigate the correlation of nasal isolates with the exclusion of particular species from a community. This technique can also be used to screen for lantibiotic producers or potentially novel antimicrobials. The assay is performed by first culturing the test inhibitor-producing strain overnight on an agar plate, then spraying over the test competitor strain and incubating again. After incubation, the extent of inhibition can be measured quantitatively, through the size of the zone of clearing around the inhibitor-producing strain, and qualitatively, by assessing the clarity of the inhibition zone. Here we present the protocol for the deferred inhibition assay, describe ways to minimize variation between experiments, and define a clarity scale that can be used to qualitatively assess the degree of inhibition.
Introduction
Bacteria living in communities compete at the interspecific and intraspecific level for space and nutrients 6. Competition between microbes can often lead to exclusion of particular species or strains within a community. Exclusion can be due to competition for a particular receptor or nutrient, or the production of an antimicrobial compound by a member of the community 6.
Studies investigating competitive exclusion frequently examine the presence and absence of species using 16S rRNA sequencing 3,4,13. However, intraspecific trait variation, for example the presence or absence of antimicrobial peptide production, can hugely impact the ability of one species to inhibit another 1. Since 16S rRNA sequencing cannot distinguish between strains of the same species, intraspecific trait variation cannot be assessed. The technique described here can be used to assess the potential of individual strains to exclude other bacteria. This method has previously been used to show a positive correlation between the presence of Staphylococcus aureus inhibitory bacteria and the absence of S. aureus in a nasal community 7.
The deferred growth inhibition (competition) assay can identify production of antimicrobial compounds or nutrient competition by the inhibitor strain. It can also detect positive interactions, whereby the presence of the inhibitor strain actually improves the growth of the competitor strain. This assay can be used to create quantitative data (zone of clearing size) and qualitative data (degree of inhibition), both of which can be overlaid onto data of the presence or absence of a species within a community to find correlations between phenotype (trait) and competitive exclusion 7.
Protocol
Representative Results
Discussion
خطوة مهمة من هذا البروتوكول منافسة الأنواع البكتيرية التي يميزه عن الآخرين، هو الحضانة بين عشية وضحاها من المانع عزل قبل إضافة عزل منافس. يتطلب سلالة المانع هذه الفترة نمو لإنتاج مركبات المثبطة. كما مضافين سلالة منافس على قمة نفس المتوسطة، هذا الأسلوب يسمح للباحث لمراقبة الإمكانات الكاملة من سلالة المانع للتدخل في النمو من سلالة منافس. ونتيجة لذلك، يعكس هذا الاختبار ما يحدث مع الطبيعة؛ تم تأسيس عزلة واحدة تماما في محراب، والآخر يجب أن يكون قادرا على مواجهة أي متغيرات المثبطة لتكون قادرة على غزو بنجاح المتخصصة.
هناك شقان لهذا البروتوكول التي هي الأكثر احتمالا للتسبب نتائج خاطئة إذا أجريت بشكل غير صحيح. أولا، التعقيم غير كامل من زجاجات المرذاذ يمكن إدخال تلوث البكتيريا في الفحص. Incubation من مرق المستخدمة لشطف زجاجة المرذاذ في الخطوة 3.6 في وعاء معقم يمكن استخدامها لتأكيد الزجاجات وتعقيمها تماما. يغسل إضافية في مجال حلول مطهرة، مثل Virkon، ويمكن استخدامها قبل غسل في سطح عامل تنظيف فعال، هو موضح في الخطوة 3.2، إذا كنت بحاجة التعقيم إضافية.
والخطوة الثانية التي قد تسبب نتائج خاطئة تتلخص في تخفيف الضغط منافس (الخطوة 6.1). إذا تمييع هو ليس الأمثل، والقياسات واضحة من تثبيط قد لا يتم بسهولة تحديد. وكان محسن هذا الاختبار باستخدام مختلف العزلات الأنفية كما مثبط لانتاج سلالات عبر مجموعة واسعة من الأنواع إيجابية الجرام وسالبة الجرام مقابل S. الذهبية SH1000 كما 7،8 منافس سلالة. وبعد ذلك تم اختباره باستخدام مختلف العنقوديات المخثرة سلبية والمخثرة إيجابية، ومنافس والسلالات المنتجة المانع. عند اختبار أجناس أخرى غير تلك المذكورة أعلاه كمنافسسلالة، قد يكون من الضروري بعض تعظيم الاستفادة من تخفيف لقيحة.
إذا العشرات وضوح تتفاوت تفاوتا كبيرا بين تكرار، فإنه قد يكون من الضروري توحيد اللقاح منافس سلالة من خلال وضع لكثافة بصرية محددة. ومع ذلك، فإن هذا سوف يزيد من وقت الفحص يأخذ لاقامة، ومن المرجح أن تقلل من عدد من سلالات أنه من الممكن معالجة في التجربة. تعديل بصريا الثقافة إلى OD المناسب باستخدام معيار مكفارلاند قد توفر البديل السريع.
واحد الحد من هذا الأسلوب هو أنه يمكن تطبيقه فقط على البكتيريا زروع. هذا هو السبب في استخدام العديد من الدراسات 16S الريباسي تسلسل للتنبؤ التفاعلات استبعاد تنافسية 3،4،13. ومع ذلك، يمكن أن التقنيات الوراثية وmetagenomic يميز فقط أفراد المجتمع إلى مستوى الأنواع، و / أو لا تمثل بشكل خاص الاختلاف سمة ضمن النوع. فمن الممكن للكشف عن الجمعية من particulع الجينة التي تكود سمة مع وجود أو عدم وجود الأنواع البكتيرية 5، ولكن هذا يتطلب قبل معرفة الجين المرجح أن تكون مرتبطة مع استبعاد الأنواع.
وهناك اعتبار السلامة من هذه التقنية هو أنه نظرا للجيل الهباء الجوي من البكتيريا، ويمكن أن تستخدم إلا في المختبرات مع خزانة السلامة مستوى 2، أو مع احتياطات السلامة مماثلة. هناك تقنيات بديلة لاختبار المنافسة بين العزلات التي تمثل الاختلاف سمة ضمن النوع ولا تولد الهباء الجوي من البكتيريا. واحدة من هذه الطريقة هي في وقت واحد العداء فحص 2. في هذه الطريقة، وتنتشر على اللقاح من عزلة واحدة على لوحة أجار، ورصدت اللقاح عزل الثاني أو طعن على رأس مرة الأولى قد جفت. وهذا من شأنه إنتاج بيئة حيث سلالات هي في منافسة مباشرة (العداء في وقت واحد)، وكلاهما المتنافسة لإنتاج مركبات المثبطة ومسح العناصر الغذائية أولا. والميزه(ه) من المؤجل فحص تثبيط النمو خلال فحص العداء في وقت واحد هو أن عزل المانع يجب أن يكون دائما على ميزة تنافسية من إنشائها بشكل كامل قبل غزو عزل منافس. هذا هو أكثر تعبيرا عن ما يمكن أن يحدث في البيئة، كما هو الحال في معظم المنافذ، وسيتم إنشاء عزلة واحدة قبل أن يتم أضاف سلالة أخرى، بدلا من اثنين العزلات التي تضاف في نفس الوقت 8.
بديل آخر لتجنب توليد الهباء الجوي من البكتيريا سيكون لإضافة منافس عزل في أكبر أجار، التي يمكن أن سكب بدلا من رش على عزل المانع. ومع ذلك، فإن حجم رأس أجار أضاف بحاجة إلى أن ما يقرب من 3 مل لضمان التغطية حتى من لوحة. داخل هذا المجلد، فإن عزل منافس لا يكون المتزايد على نفس وسائل الإعلام مثل عزل المانع، لذلك لن تعاني من انخفاض المواد المغذية. ان منافس أيضا لا تكون على اتصال مباشر مع أي المركبات المثبطة الاتحاد الوطني للعمالايل أنها تنتشر في الجزء العلوي أجار. لا يمكن وصف مثل هذا الفحص كما تثبيط المؤجلة أو العداء في وقت واحد.
وقد سبق أن استخدم طريقة مماثلة لتقييم مستويات المقاومة باسيتراسين بين S. السريري يعزل الذهبية 10. والفرق الرئيسي بين البروتوكول وصفها هنا والتي وصفت من قبل 10 سنوات، وهذا الأخير سلالات منافس السرية فقط كما الحساسة (كاملة الوضوح inhibition- تصبح النتيجة 0) أو المقاومة (جزئي دون وضوح inhibition- يسجل 1-5). لذا يمكن أن تستخدم أيضا المؤجلة فحص تثبيط النمو للكشف عن مستويات المقاومة لمنتجي الأدوية المضادة للميكروبات معينة، أو حتى للبحث عن مضادات الميكروبات جديدة فعالة ضد الجراثيم المقاومة للعقاقير المتعددة.
وقد أشير إلى أن البكتيريا المضيف يمكن التلاعب بها للقضاء على أعضاء غير مرغوب فيه من المجتمع البكتيري 9. تطبيق corynebacteria أو العنقودياتylococcus وقد ثبت البشروية بالفعل للقضاء على س. الاستعمار الذهبية في فتحتي الأنف في نسبة كبيرة من السكان 11،12. وبالتالي قد يؤدي الدراسات إلى سلالات محددة يمكن استبعاد تنافسية أعضاء غير مرغوب فيه من النباتات المضيفة، من خلال تقنيات مثل واحد هو موضح هنا، إلى العلاجات المستقبلية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويتم تمويل المجلس المشترك للبلديات من قبل جائزة BBSRC-IPA مع شركة يونيليفر بي (BB / L023040 / 1). ويتم تمويل HAG من قبل وزارة في المملكة العربية السعودية من التعليم العالي دكتوراه دراسية ل.
Materials
| Brain heart infusion broth | Lab M | lab049 | rich general purpose media |
| agar-agar | Merck Milipore | 101614 | |
| petri dishes | Sarstedt | 82.1473.001 | |
| plastic perfume vaporizer | not known | – | 10 cm high with 3.5 cm diameter clear plastic spray bottle with lid, purchased from the travel section of a supermarket |
| Universal bottles | no longer in production, alternative SLS BOT5006 | 28 ml glass cylindrical bottle (approx 280 mm diameter, 850 mm height), flat bottomed with plastic screw cap | |
| Decon 90 | Decon | surface active cleaning agent |
References
- Bolnick, D. I., et al. Why intraspecific trait variation matters in community ecology. Trends Ecol Evol. 26 (4), 183-192 (2011).
- Christensen, G. J. M., et al. Antagonism between Staphylococcus epidermidis and Propionibacterium acnes and its genomic basis. BMC Genomics. 17 (152), (2016).
- Faust, K., et al. Microbial co-occurrence relationships in the human microbiome. PloS Comput Biol. 8 (7), (2012).
- Frank, D. N., Feazel, L. M., Bessesen, M. T., Price, C. S., Janoff, E. N., Pace, N. R. The Human nasal microbiota and Staphylococcus aureus carriage. PLoS One. 5 (5), e10598 (2010).
- Fredheim, E. G., Flaegstad, T., Askarian, F., Klingenberg, C. Colonisation and interaction between S. epidermidis and S. aureus in the nose and throat of healthy adolescents. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 34, 123-129 (2015).
- Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle. Nat Rev Microbiol. 8, 15-25 (2010).
- Libberton, B., Coates, R. E., Brockhurst, M. A., Horsburgh, M. J. Evidence that intraspecific trait variation among nasal bacteria shapes the distribution of Staphylococcus aureus. Infect Immun. 82 (9), 3811-3815 (2014).
- Libberton, B., Horsburgh, M. J., Brockhurst, M. A. The effects of spatial structure, frequency dependence and resistance evolution on the dynamics of toxin-mediated microbial invasions. Evol appl. 8, 738-750 (2015).
- Liu, C. M., et al. Staphylococcus aureus and the ecology of the nasal microbiome. Sci Adv. 1, e1400216 (2015).
- Nascimento, J. S., Ceotto, H., Nascimento, S. B., Giambiagi-deMarval, M., Santos, K. R., Bastos, M. C. Bacteriocins are alternative agents for control of multiresistant staphylococcal strains. Lett Appl Microbiol. 42, 215-221 (2006).
- Park, B., Iwase, T., Liu, G. Y. Intranasal application of S. epidermidis prevents colonization by methicillin-resistant Staphylococcus aureus in mice. PLoS One. 6 (10), e25880 (2011).
- Uehara, Y., et al. Bacterial interference among nasal inhabitants: eradication of Staphylococcus aureus from nasal cavities by artificial implantation of Corynebacterium sp. J Hosp Infect. 44, 127-133 (2000).
- Wos-Oxley, M. L., et al. A poke into the diversity and associations within human anterior nare microbial communities. ISME J. 4, 839-851 (2010).
