Методика адаптивной лабораторной эволюции микроорганизмов с использованием хемостатическую
Summary
Здесь мы приводим протокол для получения адаптивной лабораторной эволюции микроорганизмов в условиях с использованием хемостате культуры. Кроме того, геномный анализ выделившегося штамма обсуждается.
Abstract
Natural evolution involves genetic diversity such as environmental change and a selection between small populations. Adaptive laboratory evolution (ALE) refers to the experimental situation in which evolution is observed using living organisms under controlled conditions and stressors; organisms are thereby artificially forced to make evolutionary changes. Microorganisms are subject to a variety of stressors in the environment and are capable of regulating certain stress-inducible proteins to increase their chances of survival. Naturally occurring spontaneous mutations bring about changes in a microorganism’s genome that affect its chances of survival. Long-term exposure to chemostat culture provokes an accumulation of spontaneous mutations and renders the most adaptable strain dominant. Compared to the colony transfer and serial transfer methods, chemostat culture entails the highest number of cell divisions and, therefore, the highest number of diverse populations. Although chemostat culture for ALE requires more complicated culture devices, it is less labor intensive once the operation begins. Comparative genomic and transcriptome analyses of the adapted strain provide evolutionary clues as to how the stressors contribute to mutations that overcome the stress. The goal of the current paper is to bring about accelerated evolution of microorganisms under controlled laboratory conditions.
Introduction
Микроорганизмы могут выжить и адаптироваться к различных средах. Под сильным стрессом, адаптация может происходить путем приобретения полезных фенотипов случайными геномных мутаций и последующего положительного отбора 1-3. Таким образом, микробные клетки могут адаптироваться путем изменения метаболических или регуляторных сетей для оптимального роста, которая называется "адаптивная эволюция". Последние важные микробные тенденции, такие как вспышки суперошибок и появления устойчивых штаммов микроорганизмов, которые очень тесно связаны с адаптивной эволюции в стрессовых условиях. В соответствии с определенными в лабораторных условиях, мы можем изучить механизмы молекулярной эволюции и даже контролировать направление эволюции микробов для различных областей применения. В отличие от многоклеточных организмов, одноклеточные организмы хорошо подходят для адаптивной лабораторной эволюции (ALE) по следующим причинам: они быстро регенерируют, они поддерживают большие группы населения, а также легко создавать и поддерживать Homogeneous среды. В сочетании с последними достижениями в области методов секвенирования ДНК и высокопроизводительных технологий, ALE позволяет непосредственное наблюдение за геномных изменений, которые приводят к системным регуляторных изменений. Мутационные динамика и разнообразие населения также наблюдается. Генная инженерия стратегии могут быть определены из анализа ALE штаммов 4,5.
Хемостатическую культура представляет собой метод , используемый для получения устойчивого состояния клеток и увеличение производительности в бродильных процессов 6. добавляют свежую среду и культуральный бульон собирают во время процесса (последняя включает в себя среду и биомассы). Долгосрочный хемостатическую культура, однако, изменяет стационарную продуктивности культуры и приводит к накоплению спонтанных мутаций и отбора в процессе культивирования (рис 1а). При различных давлениях отбора (стрессоров), накопление мутаций усиливается. Постепенное увеличение стресса в долгосрочной перспективе хемостатическую предусматривает непрерывный отбор мутаций , которые работают против заданных факторов стресса, таких как температура, рН, осмотическое давление, питательного голодания, окисления, токсичных конечных продуктов и т.д. передачи колонии от твердой среды и последовательной передачи из жидкой среды ( с повтором партия культуры) также позволяют исследователям получить эволюционировали микроорганизмы (рис 1б и 1в). Хотя хемостатическую культура требует сложных методов, пул разнообразия (количество репликаций и численности населения) выше, чем полученная путем переноса колоний и последовательные методы переноса. Стабильная воздействие стресса на отдельные клетки и снижение изменения в клеточном состоянии во время хемостатной культуры (устойчивое состояние) и другие преимущества эля по сравнению с методами культивирования на основе партий. Стресс-индуцированной ALE кишечной палочки , подвергнутой воздействию высоких янтарной условий вводится в этой статье.
Iles / ftp_upload / 54446 / 54446fig1.jpg "/>
Рисунок 1: Методы лабораторной эволюции адаптивной (А) хемостатическую;. (B) последовательный перевод; (C) перенос колонии. Верхние цифры иллюстрируют концепцию методов ALE, а нижние рисунки иллюстрируют количество клеток, выросших во время ALE. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Protocol
Representative Results
Discussion
Микроорганизмы способны адаптироваться к практически во всех средах из-за их быстрого темпа роста и генетического разнообразия. Эволюция Адаптивная лаборатория позволяет микроорганизмы развиваться при условиях, разработанных, что обеспечивает способ выбора отдельных организмов, у?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was financially supported by the Korean Ministry of Science, ICT and Future Planning (Intelligent Synthetic Biology Center program 2012M3A6A8054887). P. Kim was supported by a fellowship from the Catholic University of Korea (2015).
Materials
| Mini-chemostat fermentor | Biotron Inc. | – | manufactured by special order |
| silicon tubing | Cole-Parmer | Masterflex L/S 13 | tubing size can be varied depending on the dilution rate and the size of fermentor jar. |
| reservoir jar | Bellco | Media storage bottle | 20 L |
| chemicals | Sigma-Aldrich | – | reagent grade |
| glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | ACS reagent |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 | for molecular biology, suitable for cell culture, ≥99.5% |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 746398 | ACS reagent, ≥99% |
| Na2HPO4·2H2O | Sigma-Aldrich | 4272 | 98.5-101% |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 795488 | ACS reagent, ≥99% |
| MgSO4·7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | ACS reagent, ≥98% |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 793639 | ACS reagent, ≥96% |
| thiamine·HCl | Sigma-Aldrich | T4625 | reagent grade, ≥99% |
| Na2·succinate·6H2O | Sigma-Aldrich | S2378 | ReagentPlus, ≥99% |
References
- Rando, O. J., Verstrepen, K. J. Timescales of genetic and epigenetic inheritance. Cell. 128, 655-668 (2007).
- Kim, H. J., et al. Short-term differential adaptation to anaerobic stress via genomic mutations by Escherichia coli strains K-12 and B lacking alcohol dehydrogenase. Front Microbiol. 5, 476 (2014).
- Mendizabal, I., Keller, T. E., Zeng, J., Yi, S. V. Epigenetics and evolution. Integr Comp Biol. 54, 31-42 (2014).
- Lee, J. Y., Seo, J., Kim, E. S., Lee, H. S., Kim, P. Adaptive evolution of Corynebacterium glutamicum resistant to oxidative stress and its global gene expression profiling. Biotechnol Lett. 35, 709-717 (2013).
- Lee, J. Y., et al. Artificial oxidative stress-tolerant Corynebacterium glutamicum. AMB Express. 4, 15 (2014).
- Narang, A. The steady states of microbial growth on mixtures of substitutable substrates in a chemostat. J Theor Biol. 190, 241-261 (1998).
- Kwon, Y. D., Kim, S., Lee, S. Y., Kim, P. Long-term continuous adaptation of Escherichia coli to high succinate stress and transcriptome analysis of the tolerant strain. J Biosci Bioeng. 111, 26-30 (2011).
- Barrick, J. E., Lenski, R. E. Genome dynamics during experimental evolution. Nat Rev Genet. 14, 827-839 (2013).
- Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).
- McKenna, A., et al. The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data. Genome Res. 20, 1297-1303 (2010).
- Deatherage, D. E., Barrick, J. E. Identification of mutations in laboratory-evolved microbes from next-generation sequencing data using breseq. Methods Mol Biol. 1151, 165-188 (2014).
