Summary

उपन्यास आरएनए बंधनकारी प्रोटीन अलगाव तेजी पद्धति द्वारा

Published: September 30, 2016
doi:

Summary

RNA-protein interactions lie at the heart of many cellular processes. Here, we describe an in vivo method to isolate specific RNA and identify novel proteins that are associated with it. This could shed new light on how RNAs are regulated in the cell.

Abstract

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern biology. Only a few in vitro and in vivo methods enable the identification of RBPs associated with a particular target mRNA. However, their main limitations are the identification of RBPs in a non-cellular environment (in vitro) or the low efficiency isolation of RNA of interest (in vivo). An RNA-binding protein purification and identification (RaPID) methodology was designed to overcome these limitations in yeast and enable efficient isolation of proteins that are associated in vivo. To achieve this, the RNA of interest is tagged with MS2 loops, and co-expressed with a fusion protein of an MS2-binding protein and a streptavidin-binding protein (SBP). Cells are then subjected to crosslinking and lysed, and complexes are isolated through streptavidin beads. The proteins that co-purify with the tagged RNA can then be determined by mass spectrometry. We recently used this protocol to identify novel proteins associated with the ER-associated PMP1 mRNA. Here, we provide a detailed protocol of RaPID, and discuss some of its limitations and advantages.

Introduction

शाही सेना बाध्यकारी प्रोटीन (RBPs) एस के बारे में 10% का प्रतिनिधित्व cerevisiae प्रोटीन 1,2 और स्तनधारी प्रोटीन 3-5 के बारे में 15%। वे इस तरह के mRNA के बाद ट्रांसक्रिप्शनल प्रसंस्करण और विनियमन, अनुवाद, राइबोसोम जीवजनन, tRNA Aminoacylation और संशोधन, क्रोमेटिन remodeling, और अधिक के रूप में कई सेलुलर प्रक्रियाओं में फंसा रहे हैं। RBPs का एक महत्वपूर्ण उपसमूह mRNA बाध्यकारी प्रोटीन (mRNPs) 6.7 है। MRNA परिपक्वता के पाठ्यक्रम में, अलग-अलग RBPs प्रतिलेख बाँध और नाभिक, सेलुलर स्थानीयकरण, अनुवाद और गिरावट 6-8 से बाहर अपने परमाणु प्रसंस्करण, निर्यात मध्यस्थता। इस प्रकार, किसी भी समय बिंदु पर एक विशेष प्रतिलिपि के लिए बाध्य RBPs के अलग सेट इसके प्रसंस्करण और अंत में अपने भाग्य का निर्धारण करता है।

एक mRNA के साथ जुड़े RBPs की पहचान काफी उनके बाद के transcriptional विनियमन अंतर्निहित प्रक्रियाओं के बारे में हमारी समझ को सुधार सकता है। विविध आनुवंशिकसूक्ष्म, जैव रासायनिक और जैव सूचना विज्ञान के तरीकों mRNA विनियमन (9-11 में समीक्षा) में शामिल प्रोटीन की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। हालांकि, केवल एक इन तरीकों में से कुछ एक विशेष लक्ष्य mRNA के साथ जुड़े प्रोटीन की पहचान सकें। नोट के खमीर तीन संकर प्रणाली (Y3H) है, जो खमीर कोशिकाओं में एक अभिव्यक्ति पुस्तकालय स्क्रीन करने के लिए प्रलोभन के रूप में ब्याज की mRNA का इस्तेमाल करता है। सकारात्मक क्लोन आमतौर पर एक विकास चयन या संवाददाता अभिव्यक्ति 12-14 के माध्यम से मनाया जाता है। इस विधि का मुख्य लाभ यह प्रोटीन है कि एक सेलुलर पर्यावरण और आरएनए प्रोटीन बातचीत की ताकत को मापने की क्षमता में स्कैन किया जा सकता की बड़ी संख्या है। कमियां गैर विशिष्ट बंधन के कारण झूठी सकारात्मक परिणाम की अपेक्षाकृत बड़ी संख्या है, और कारण भाग में झूठी नकारात्मक परिणाम, संलयन प्रोटीन शिकार या चारा शाही सेना के misfolding करने के लिए, के लिए उच्च क्षमता शामिल हैं।

आनुवंशिक दृष्टिकोण के लिए एक वैकल्पिक समानता purifi हैउसके संबंधित प्रोटीन के साथ शाही सेना के केशन। पाली ए-युक्त mRNAs oligo डीटी स्तंभों के उपयोग के माध्यम से अलग किया जा सकता है, और उनके जुड़े प्रोटीन मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा पता चला रहे हैं। आरएनए प्रोटीन बातचीत crosslinking द्वारा अपने सेलुलर संदर्भ है, जो कम दूरी के सहसंयोजक बांड बनाता में संरक्षित है। Oligo डीटी स्तंभ का उपयोग करें कि एक-युक्त mRNA 3,5,15 किसी भी पाली साथ जुड़ा हुआ है पूरे proteome के एक वैश्विक दृष्टि अर्जित करता है। बहरहाल, यह है कि एक विशेष mRNA के साथ जुड़े रहे हैं प्रोटीन की एक सूची प्रदान नहीं करता है। बहुत कुछ तरीकों जैसे एक पहचान हासिल करने के लिए उपलब्ध हैं। जोड़ी विधि लक्ष्य mRNA 16,17 को पूरकता के साथ न्यूक्लिक एसिड की अभिकर्मक पर जोर देता। न्यूक्लिक एसिड भी एक पेप्टाइड, जो बातचीत साइट के लिए पास के इलाके में RBPs करने की अनुमति देता है crosslinking से जुड़ा हुआ है। crosslinking के बाद, RBP पेप्टाइड न्यूक्लिक एसिड पृथक और प्रोटिओमिक्स विश्लेषण के अधीन किया जा सकता है। हाल ही में, एक aptamer आधारित कार्यप्रणाली थासफलतापूर्वक स्तनधारी सेल लाइनों 18 से अर्क के लिए आवेदन किया। streptavidin में सुधार आत्मीयता के साथ एक शाही सेना aptamer विकसित की है और इस मामले में (एयू-अमीर तत्व (हैं)) ब्याज के एक दृश्य के लिए जुड़े हुए किया गया था। aptamer A- हैं आरएनए streptavidin मोतियों से जुड़ी है और सेल lysate के साथ मिलाया गया था। प्रोटीन है कि अनुक्रम के साथ जुड़े शुद्ध और मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) द्वारा की पहचान की गई। इस विधि का पता चला हालांकि संघों कि सेलुलर सेटिंग्स (यानी, इन विट्रो) के बाहर होते हैं, यह भविष्य में संशोधित किया जा करने के लिए इतनी के रूप में जीनोम में aptamers लागू करने के लिए और इस तरह सक्षम mRNA के साथ जुड़े प्रोटीन के अलगाव की संभावना है, जबकि सेलुलर परिवेश (यानी, इन विवो)। खमीर, जहां आनुवंशिक जोड़तोड़ अच्छी तरह से स्थापित कर रहे हैं, तेजी से विधि (प्रो जेफ Gerst प्रयोगशाला में विकसित) विवो संघों 19 के एक दृश्य प्रदान करता है। तेजी से विशिष्ट और मजबूत MS2 कोट प्रोटीन के बंधन (MS2- को जोड़ती हैसीपी) MS2 आरएनए अनुक्रम, और streptavidin बाध्यकारी डोमेन (एसबीपी) के संयुग्मित मोती streptavidin करने के लिए। इस streptavidin मोती के माध्यम से MS2 टैग mRNAs का कुशल शुद्धि सक्षम बनाता है। इसके अलावा, MS2 छोरों की 12 प्रतियों की अभिव्यक्ति आरएनए को एक साथ बाँध और अपने अलगाव की दक्षता बढ़ाने के लिए छह MS2-सीपीएस अप करने के लिए अनुमति देता है। इस प्रोटोकॉल इसलिए एक बार eluted नमूने मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा प्रोटिओमिक्स विश्लेषण के अधीन हैं उपन्यास mRNA जुड़े प्रोटीन की पहचान सकें सुझाव दिया गया था।

हमने हाल ही में खमीर PMP1 mRNA 20 के साथ जुड़े उपन्यास प्रोटीन की पहचान करने के लिए तेजी से उपयोग किया। PMP1 mRNA पहले ईआर झिल्ली के साथ जुड़े होने के लिए और अपनी 3 'untranslated क्षेत्र (UTR) इस संघ 21 में एक प्रमुख निर्धारक हो पाया था दिखाया गया था। इस प्रकार, RBPs कि PMP1 3 'UTR बाँध अपने स्थानीयकरण में एक महत्वपूर्ण भूमिका अदा की संभावना है। तेजी से तरल chromatograph के द्वारा पीछाY-मास स्पेक्ट्रोमेट्री / मास स्पेक्ट्रोमेट्री (नियंत्रण रेखा एमएस / एमएस) कई नए प्रोटीन है कि PMP1 20 के साथ बातचीत की पहचान में हुई। इस के साथ साथ, हम तेजी से कार्यप्रणाली का एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, महत्वपूर्ण नियंत्रण की जरूरत है कि कुछ किया जाना है, और तकनीकी सुझाव है कि उपज और विशिष्टता सुधार हो सकता है।

Protocol

नोट: 12 MS2 बाध्यकारी साइटों से मिलकर एक दृश्य डालें (MS2 छोरों; MS2L) वांछित जीनोमिक ठिकाना में, आमतौर पर खुला पढ़ने फ्रेम (ओआरएफ) और 3 'UTR के बीच। इस एकीकरण के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल कहीं और 22 प्रदान की जाती ?…

Representative Results

रैपिड उसके संबंधित प्रोटीन के साथ एक विशेष लक्ष्य शाही सेना के अलगाव सक्षम बनाता है। इसकी सफलता के लिए महत्वपूर्ण आरएनए बरकरार रखे हुए है जितना संभव हो, जिससे प्रोटीन के लिए पर्याप्त मात्?…

Discussion

विभिन्न तरीकों विशिष्ट mRNAs का अलगाव का उपयोग अपने जुड़े प्रोटीन 11,34 35 की पहचान करने के लिए। इन तरीकों में इन विट्रो और इन विवो रणनीतियों में लागू आरएनए प्रोटीन बातचीत की जांच के लिए। इ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

हम तेजी से प्रोटोकॉल स्थापित करने और आवश्यक plasmids प्रदान करने में उनकी मददगार सलाह के लिए प्रो जेफ Gerst और बोरिस Slobodin धन्यवाद। हम यह भी नियंत्रण रेखा एमएस / एमएस विश्लेषण के साथ उसकी मदद के लिए इस प्रोटोकॉल और Smoler प्रोटिओमिक्स केंद्र से डॉ तामार Ziv स्थापित करने में उसकी मदद के लिए डॉ Avigail Atir-Lande धन्यवाद। हम YEF3 एंटीबॉडी के लिए प्रो टीजी Kinzy (रटगर्स) धन्यवाद। इस काम Binational विज्ञान फाउंडेशन से अनुदान 2011013 द्वारा समर्थित किया गया।

Materials

Tris sigma T1503
SDS bio-lab 1981232300
DTT sigma D9779
Acidic Phenol (pH 4.3) sigma P4682
Acidic Phenol: Chloroform (5:1, pH 4.3) sigma P1944
Chloroform bio-lab 3080521
Formaldehyde Frutarom 5551820
Glycine sigma G7126
NP-40 Calbiochem 492016
Heparin Sigma H3393
Phenylmethylsulfonyl Flouride (PMSF) Sigma P7626
Leupeptin Sigma L2884
Aprotinin Sigma A1153
Soybean Trypsin Inhibitor Sigma T9003
Pepstatin Sigma P5318
DNase I Promega M610A
Ribonuclease  Inhibitor Takara 2313A
Glass Beads Sartorius BBI-8541701 0.4-0.6mm diameter 
Mini BeadBeater BioSpec Mini BeadBeater 16
Guanidinium Sigma G4505
Avidin Sigma A9275
Streptavidin Beads GE Healthcare  17-5113-01
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A7906
Yeast tRNA Sigma R8508
Biotin Sigma B4501
Yeast extract Bacto 288620
peptone Bacto 211677
Glucose Sigma G8270
1 x Phosphate-Buffered saline (PBS)
0.2 M NaOH
4 x Laemmli Sample Buffer (LSB) 0.2 M Tris-Hcl pH 6.8, 8% SDS, 0.4 M DTT, 40% glycerol, 0.04% Bromophenol-Blue.
Hot phenol lysis buffer 10 mM Tris pH 7.5, 10 mM EDTA, 0.5% SDS 
3 M Sodium Acetate pH 5.2
100% and 70% Ethanol (EtOH)
RNase-free water
RaPID lysis buffer 20 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 1.8 mM MgCl2, 0.5% NP-40, 5 mg/ml Heparin, 1 mM Dithiothreitol (DTT), 1 mM Phenylmethylsulfonyl Flouride (PMSF), 10 µg/ml Leupeptin, 10 µg/ml Aprotinin, 10 µg/ml Soybean Trypsin Inhibitor, 10 µg/ml Pepstatin, 20 U/ml DNase I, 100 U/ml Ribonuclease  Inhibitor.
2x Cross-linking reversal buffer 100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 20 mM DTT, 2 % SDS.
RaPID wash buffer 20 mM Tris-HCl pH 7.5,  300 mM NaCl, 0.5% NP-40
0.5 M EDTA pH 8
Silver Stain Plus Kit Bio-Rad  161-0449 For detecting proteins in polyacrylamide gels
SD selective medium  1.7 g/l Yeast nitrogen base with out amino acids and ammonium sulfate, 5 g/l Ammonium sulfate, 2% glucose, 350 mg/l Threonine, 40 mg/l Methionine, 40 mg/l Adenine, 50 mg/l Lysine, 50 mg/l Tryptophan, 20 mg/l Histidine, 80 mg/l Leucine, 30 mg/l Tyrosine, 40 mg/l Arginine
Anti-eEF3 (EF3A,YEF3) Gift from Kinzy TG. (UMDNJ Robert Wood Johnson Medical School) 1:5,000
Anti GFP antibody Santa Cruz sc-8334 1:3,000
Anti rabbit IgG-HRP conjugated SIGMA A9169 1:10,000

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Cite This Article
Samra, N., Arava, Y. Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology. J. Vis. Exp. (115), e54467, doi:10.3791/54467 (2016).

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