Novel RNA-bindende proteiner Isolering av den raske Methodology

Summary

RNA-protein interactions lie at the heart of many cellular processes. Here, we describe an in vivo method to isolate specific RNA and identify novel proteins that are associated with it. This could shed new light on how RNAs are regulated in the cell.

Abstract

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern biology. Only a few in vitro and in vivo methods enable the identification of RBPs associated with a particular target mRNA. However, their main limitations are the identification of RBPs in a non-cellular environment (in vitro) or the low efficiency isolation of RNA of interest (in vivo). An RNA-binding protein purification and identification (RaPID) methodology was designed to overcome these limitations in yeast and enable efficient isolation of proteins that are associated in vivo. To achieve this, the RNA of interest is tagged with MS2 loops, and co-expressed with a fusion protein of an MS2-binding protein and a streptavidin-binding protein (SBP). Cells are then subjected to crosslinking and lysed, and complexes are isolated through streptavidin beads. The proteins that co-purify with the tagged RNA can then be determined by mass spectrometry. We recently used this protocol to identify novel proteins associated with the ER-associated PMP1 mRNA. Here, we provide a detailed protocol of RaPID, and discuss some of its limitations and advantages.

Introduction

RNA-bindende proteiner (RBPs) utgjør ca 10% av S. cerevisiae-proteiner ^1,2 og omtrent 15% av pattedyrproteiner ^3-5. De er innblandet i mange cellulære prosesser som mRNA post-transcriptional behandling og regulering, oversettelse, ribosom biogenesis, tRNA aminoacylering og modifikasjon, kromatin remodeling, og mer. En viktig undergruppe av RBPs blir mRNA-bindende proteiner (mRNPs) ^6,7. I løpet av mRNA modning, ulike RBPs binde transkripsjon og formidle sitt atom foredling, eksport ut av kjernen, cellulær lokalisering, oversettelse og degradering ^6-8. Dermed blir distinkt sett med RBPs bundet til et bestemt transkript som helst punkt bestemmer dens behandling og til slutt dets skjebne.

Identifiseringen av RBPs forbundet med en mRNA kunne forbedre vår forståelse av prosessene som ligger bak deres post-transcriptional regulering. Diverse genetisk, Mikroskopiske, biokjemiske og bioinformatikk metoder har blitt brukt for å identifisere proteiner involvert i mRNA regulering (anmeldt i ^9-11). Imidlertid er bare noen få av disse fremgangsmåter muliggjøre identifisering av proteiner forbundet med en bestemt mål-mRNA. Av notatet er Gjær Tre hybrid system (Y3H), som utnytter mRNA av interesse som agn for å screene et uttrykk bibliotek i gjærceller. Positive kloner blir vanligvis observeres gjennom et utvalg vekst eller reporter uttrykk ^12-14. Den viktigste fordelen med denne fremgangsmåten er det store antall proteiner som kan skannes i et cellulært miljø og evnen til å måle styrken av RNA-proteininteraksjon. Ulemper omfatter relativt stort antall falske positive resultater på grunn av ikke-spesifikk binding, og stort potensial for falske negative resultater skyldes delvis, til misfolding av fusjonsproteinet byttedyr eller agn RNA.

Et alternativ til den genetiske tilnærmingen er Affiniteten purifierkasjon av RNA med assosierte proteiner. Poly A-inneholdende mRNA kan bli isolert ved hjelp av oligo dT-kolonner, og deres assosierte proteiner blir detektert ved massespektrometri. RNA-protein interaksjon er bevart i sin cellulære sammenheng ved kryssbinding, noe som gjør kort rekkevidde kovalente bindinger. Bruken av oligo dT-kolonnen gir en global oversikt over hele proteome som er forbundet med en hvilken som helst poly A-holdig mRNA ^3,5,15. Men dette betyr ikke gi en liste over proteiner som er knyttet til en bestemt mRNA. Svært få metoder er tilgjengelige for å utføre en slik identifikasjon. Paret Fremgangsmåten innebærer at transfeksjon av nukleinsyre med komplementære til mål-mRNA ^16,17. Nukleinsyre er også knyttet til et peptid, som gjør det mulig kryssbinding til RBPs i umiddelbar nærhet til samspillet nettstedet. Etter tverrbinding, kan den RBP-peptid-nukleinsyre isoleres og underkastes proteomikk analyse. Nylig, en aptamer basert metodikk varvellykket anvendt utdrag fra pattedyrcellelinjer ^18. En RNA aptamer med forbedret affinitet for streptavidin ble utviklet og sammensmeltet til en sekvens av interesse (AU-rik element (er), i dette tilfellet). Den aptamer-ARE RNA ble festet til streptavidin perler og blandet med cellelysat. Proteiner som er forbundet med ARE-sekvensen ble renset og identifisert ved massespektroskopi (MS). Selv om denne metoden har oppdaget forbindelser som oppstår utenfor de cellulære innstillinger (dvs. in vitro), er det sannsynlig å være endret i fremtiden, for derved å innføre aptamerer inn i genomet og derved muliggjøre isolering av proteiner forbundet med mRNA, mens i cellulært miljø (dvs. in vivo). I gjær, hvor genetiske manipulasjoner er godt etablert, den raske metoden (utviklet i Prof. Jeff Gerst lab) gir en visning av in vivo foreninger ^19. RAPID kombinerer spesifikke og sterke binding av MS2-kappeprotein (MS2-CP) for å MS2 RNA-sekvens, og av den streptavidin-bindende domene (SBP) for å streptavidin konjugerte perler. Dette muliggjør effektiv rensing av MS2-merket mRNA gjennom streptavidin perler. Videre tillater ekspresjon av 12 kopier av MS2 sløyfer opptil seks MS2-KP til å binde samtidig til RNA og øke effektiviteten av isolasjonen. Denne protokollen ble derfor foreslått for å muliggjøre identifisering av nye mRNA-assosierte proteiner når de eluerte prøvene underkastes proteomforskning analyse ved massespektrometri.

Vi har nylig benyttet hurtig for å identifisere nye proteinene forbundet med gjær PMP1 ^mRNA-20. PMP1 mRNA ble tidligere vist å være assosiert med ER membranen og dens 3'-utranslatert region (UTR) ble funnet å være en viktig bestemmende faktor i denne krets ^21. Således RBPs som binder PMP1 3 'UTR vil kunne spille en viktig rolle i dets lokalisering. Hurtig etterfulgt av væskekromatografy-massespektrometri / massespektrometri (LC-MS / MS) resulterte i identifisering av mange nye proteiner som interagerer med PMP1 ^20. Heri gir vi en detaljert protokoll av den raske metodikk, viktige kontroller som må gjøres, og tekniske tips som kan forbedre utbyttet og spesifisitet.

Protocol

Merk: Sett en sekvens bestående av 12 MS2-bindingsseter (MS2 løkker; MS2L) inn i den ønskede genomiske lokuset, vanligvis mellom den åpne leserammen (ORF), og den 3 'UTR. En detaljert protokoll for denne integreringen er gitt andre steder 22. Kontroller riktig innsetting og uttrykk med PCR, Nord-analyse eller RT-PCR 20,23. Det er viktig å kontrollere at integreringen ikke gripe inn med syntesen av 3'UTR. I tillegg bør et plasmid som uttrykker-MS2-CP fusjonert til SBP under ekspresjone…

Representative Results

RAPID muliggjør isolering av en spesifikk mål-RNA med assosierte proteiner. Kritisk for dens suksess er å holde den RNA intakte så mye som mulig, for derved å oppnå en tilstrekkelig mengde av proteiner. For å bestemme isolasjon effektiviteten og kvaliteten av RNA, er northern analyse utført (figur 1A). Nord-analyse har fordelen av direkte rapportering effektiviteten og kvaliteten av raske. Således kan de relative mengder av full lengde og nedbrytningsproduktene …

Discussion

Forskjellige fremgangsmåter bruker isolasjon av spesifikke mRNA for å identifisere de tilknyttede proteiner ^{11,34 35.} Disse fremgangsmåter gjelder in vitro og in vivo strategier for å probe RNA-protein interaksjoner. In vitro metoder Inkuber eksogent transkribert RNA med cellelysat å fange RBPs og isolere RNP komplekser ^36,37. En effektiv tilnærming av denne typen ble presentert nylig, noe som muliggjorde identifisering av nye proteiner som binder en regu…

Materials

Tris	sigma	T1503
SDS	bio-lab	1981232300
DTT	sigma	D9779
Acidic Phenol (pH 4.3)	sigma	P4682
Acidic Phenol: Chloroform (5:1, pH 4.3)	sigma	P1944
Chloroform	bio-lab	3080521
Formaldehyde	Frutarom	5551820
Glycine	sigma	G7126
NP-40	Calbiochem	492016
Heparin	Sigma	H3393
Phenylmethylsulfonyl Flouride (PMSF)	Sigma	P7626
Leupeptin	Sigma	L2884
Aprotinin	Sigma	A1153
Soybean Trypsin Inhibitor	Sigma	T9003
Pepstatin	Sigma	P5318
DNase I	Promega	M610A
Ribonuclease  Inhibitor	Takara	2313A
Glass Beads	Sartorius	BBI-8541701	0.4-0.6mm diameter
Mini BeadBeater	BioSpec	Mini BeadBeater 16
Guanidinium	Sigma	G4505
Avidin	Sigma	A9275
Streptavidin Beads	GE Healthcare	17-5113-01
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	A7906
Yeast tRNA	Sigma	R8508
Biotin	Sigma	B4501
Yeast extract	Bacto	288620
peptone	Bacto	211677
Glucose	Sigma	G8270
1 x Phosphate-Buffered saline (PBS)
0.2 M NaOH
4 x Laemmli Sample Buffer (LSB)			0.2 M Tris-Hcl pH 6.8, 8% SDS, 0.4 M DTT, 40% glycerol, 0.04% Bromophenol-Blue.
Hot phenol lysis buffer			10 mM Tris pH 7.5, 10 mM EDTA, 0.5% SDS
3 M Sodium Acetate pH 5.2
100% and 70% Ethanol (EtOH)
RNase-free water
RaPID lysis buffer			20 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 1.8 mM MgCl2, 0.5% NP-40, 5 mg/ml Heparin, 1 mM Dithiothreitol (DTT), 1 mM Phenylmethylsulfonyl Flouride (PMSF), 10 µg/ml Leupeptin, 10 µg/ml Aprotinin, 10 µg/ml Soybean Trypsin Inhibitor, 10 µg/ml Pepstatin, 20 U/ml DNase I, 100 U/ml Ribonuclease  Inhibitor.
2x Cross-linking reversal buffer			100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 20 mM DTT, 2 % SDS.
RaPID wash buffer			20 mM Tris-HCl pH 7.5,  300 mM NaCl, 0.5% NP-40
0.5 M EDTA pH 8
Silver Stain Plus Kit	Bio-Rad	161-0449	For detecting proteins in polyacrylamide gels
SD selective medium			1.7 g/l Yeast nitrogen base with out amino acids and ammonium sulfate, 5 g/l Ammonium sulfate, 2% glucose, 350 mg/l Threonine, 40 mg/l Methionine, 40 mg/l Adenine, 50 mg/l Lysine, 50 mg/l Tryptophan, 20 mg/l Histidine, 80 mg/l Leucine, 30 mg/l Tyrosine, 40 mg/l Arginine
Anti-eEF3 (EF3A,YEF3)	Gift from Kinzy TG. (UMDNJ Robert Wood Johnson Medical School)		1:5,000
Anti GFP antibody	Santa Cruz	sc-8334	1:3,000
Anti rabbit IgG-HRP conjugated	SIGMA	A9169	1:10,000