Rask og konkret vurdering av halogene peroxydaseaktivitet i Leukocytt-anriket blodprøver

Summary

This protocol describes the quick enrichment of leukocytes from small blood samples for a subsequent specific determination of the halogenating peroxidase activity within the cells. The method can be applied to human and non-human material and may contribute to the evaluation of new inflammatory markers.

Abstract

I denne artikkelen en protokoll for rask og standardisert anrikning av leukocytter fra små fullblodprøver, er beskrevet. Denne fremgangsmåten er basert på hypotonisk lysering av erytrocytter og kan brukes til humane prøver, så vel som til blod av ikke-human opprinnelse. Den lille innledende prøvevolum på ca 50 til 100 ul gjør denne metoden anvendelig for å tilbakevendende blodprøver fra små forsøksdyr. Videre er leukocytter berikelse oppnådd i løpet av minutter, og med lave materielle innsats angående kjemikalier og instrumentering, noe som gjør denne metoden er aktuelt i flere laboratorier.

Standardisert rensing av leukocytter er kombinert med en meget selektiv farging metode for å evaluere halogenerende peroksydase-aktivitet av heme peroksidaser, myeloperoksidase (MPO) og eosinofil peroksidase (EPO), dvs. dannelse av underklorsyrling og underbromsyrling (HOCl og HOBr). Mens MPO er sterkt uttrykt i neutrophils, den mest vanlige immuncelletype i humant blod så vel som i monocytter, den tilknyttede enzym EPO er utelukkende uttrykt i eosinofiler. Halogene aktiviteten til disse enzymene blir adressert ved hjelp av nesten HOCl- og HOBr-spesifikk fargestoff aminofenyl fluorescein (APF) og den primære peroksydasesubstrat hydrogenperoksyd. Ved etterfølgende strømningscytometri-analyse alle peroksidase-positive celler (nøytrofiler, monocytter, eosinofiler) kan skilles og deres halogenerings peroksydase-aktivitet kan kvantifiseres. Siden APF-farging kan kombineres med påføringen av celleoverflatemarkører, kan denne protokollen bli utvidet til spesielt adresse leukocytt sub-fraksjoner. Metoden kan brukes til å oppdage HOCl og HOBr produksjon både i menneskelig og gnager leukocytter.

Gitt allment og diversely diskutert immunologisk rollen til disse enzymatiske produktene i kroniske inflammatoriske sykdommer, kan denne protokollen bidra til en bedre forståelse avimmunologiske relevansen av leukocytter-avledet heme peroxidases.

Introduction

Polymorfonukleære leukocytter (PMN, også kalt granulocytter og monocytter) representerer viktige cellulære komponenter i det medfødte immunsystemet i blodet ^1,2. De bidrar til det primære forsvar mot patogener, så vel som til aktiveringen av ervervet immunsystemet og initiering av en systemisk inflammatorisk respons ^2-4. Likevel spesielt nøytrofile, den mest tallrike typen granulocytter og monocytter også bidra vesentlig til regulering og avslutning av akutte inflammatoriske hendelser ^5. Derfor er disse cellene kan også spille en viktig rolle i kroniske inflammatoriske sykdommer som reumatoid artritt ^6,7. Faktisk, astma, kronisk inflammatorisk luftveissykdom, er preget av en svekket apoptose av eosinofiler, den nest mest granulocytter type i blodet ^åtte. Men apoptose av granulocytter og deres rask fjerning av makrofager er to viktige skritt i løpet av mobiltermineringsav betennelse ^9-11.

I de navngitte immunceller to nært beslektede enzymer, nemlig Myeloperoxidase (MPO, nøytrofile granulocytter og monocytter) og eosinofil peroksidase (EPO, eosinofile) finnes ^12,13. Disse heme peroksydaser er klassisk relatert til den humorale immunrespons som de to-elektronisk oksidere (pseudo) halogenider til de tilsvarende hypo (pseudo) halogensyrer som er kjent for sin bakteriedrepende egenskaper ^14-16. Under fysiologiske betingelser MPO hovedsakelig danner underklorsyrling (HOCl) og hypothiocyanite ^(- OSCN) mens den sistnevnte og hypobromsyre (HOBr) er dannet av EPO ^17-19. Nye resultater tyder på at dette (pseudo) halogeneenzymaktivitet kan også bidra til reguleringen av betennelsesreaksjoner og til oppsigelse av immunreaksjoner ^20,21. Faktisk ble det HOCl produksjon av MPO og avledede produkter vist seg å undertrykke T-cellebasert adaptive immunresponser ^22-24.

For å få mer innsikt i den immunologiske rolle av leukocytter fra det medfødte immunsystemet ved kroniske inflammatoriske sykdommer og for å bestemme bidraget av MPO og EPO til denne fysiologiske funksjon vi utviklet en metode for raskt å berike leukocytter fra små blodprøver for en etterfølgende spesifikk bestemmelse av halogene peroksydase-aktivitet i disse cellene. For erytrocytt uttømming har vi valgt en standardisert metode som omfatter to påfølgende hypotone lysis trinn med destillert vann, noe som fører til en rask leukocytt anrikning ved lave materialkostnader. For den etterfølgende bestemmelse av halogene MPO og EPO aktivitet og HOCl- HOBr-spesifikk fargestoff aminofenyl fluorescein (APF) ble anvendt ^25-27. I motsetning til anvendelsen av uspesifikk peroxidase farvemetoder ^28,29, lar denne tilnærmingen selektiv påvisning av halogene peroksydase-aktivitet, som ofte blir svekket ved alvorlige inflinflammasjon ^30,31.

Protocol

Alle humane blodprøver ble tatt fra friske frivillige, og brukes leukocytter berikelse protokollen følger retningslinjene for etikk provisjon av Det medisinske fakultet ved Universitetet i Leipzig. Forsøkene med rotte blod ble godkjent av ansvarlig lokal etisk komité (Landesdirektion Sachsen, Referat 24), i henhold til de tyske retningslinjer for dyr omsorg og bruk. 1. Forsøksoppsett MERK: Som hypotonisk lyseringsprosedyren for uttømming av erytrocytter fra b…

Representative Results

Som rapportert tidligere fremgangsmåten beskrevet ovenfor viste seg å være anvendelig både for mennesker og til ikke-menneskelige materiale 32. Videre, som vist for mus med astmatiske symptomer APF flekker kan være et passende verktøy for å detektere forskjeller i den systemiske pro-inflammatorisk status. Derfor i en senere studie vi brukte denne protokollen for å gjentatte ganger evaluere halogene aktivitet av MPO (og EPO) hos hunn Mørk Agouti rotter med pri…

Discussion

Som neutrofiler er de mest tallrike leukocytter i humant blod isolering av peroksidase-positive celler fokuserer ofte bare på disse cellene, og inkluderer en separasjon av neutrofiler fra andre leukocytter ved tetthetsgradient sentrifugering ^38. Likevel som neutrofiler er mye mindre rik på murine blodprøver ³⁹ for de sistnevnte mer kompliserte metoder må benyttes ^40. Videre har begge metoder også føre til fjerning av peroksidase-positive monocytter fra prøvene og, på grunn av beh…

Materials

materials/equipment
15 ml centrifugation tubes	VWR/Corning	734-0451	–
1.5 ml sample tubes	VWR/Eppendorf	211-2130DE	–
Pipettes for volumes up to 5 ml	Eppendorf	e.g. 3120000070	We are using Eppendorf Resarch plus pipettes with adjustable volumes in the range 1-10 µl, 10-100µl, 100-1000 µl an 500-5000µl
laminar flow bench	Thermo Electron Corperation	HeraSafe	–
Vortex mixer	Bender & Hobein AG	Vortex Genie 2	–
Tabletop centrifuge	Kendro Laboratory Products	Laborfuge 400R	The centrifuge should be able to be used at 450x g
Small centrifuge	eppendorf	5415D	The centrifuge should be able to be used at 400x g
Incubator	Heraeus	cytoperm 2	Settings: 37 °C, 95% humidity, 5 % CO2 content
UV-Vis spectrophotometer	Varian	Cary 50 bio	A spectrum between 200 and 300 nm has to be recorded. Thus quartz cuvettes have to be applied
Flow cytometer	Becton, Dickinson	BD Facs Calibur	Any flow cytometer can be used which is equiped with a laser suitable for the excitation of fluorescein (e.g 488 nm argon laser)
Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
Phosphate buffered saline (PBS)	amresco	K812	sterile solution, ready to use
	Sigma-Aldrich	P4417	tablets for solving in 200 ml millipore water
Hanks balanced salt solution (HBSS) with Ca(2+)	Sigma-Aldrich	H1387	970 mg/100 ml, carefully check and adjust the pH value to 7.4
Hydrochloric acid	Merck Millipore	1.09057.1000	1M solution
Sodium hydroxide	Riedel-deHaën	30620	Solid pellets. For a 1M solution solve 4 g/100 ml Millipore water
Aminophenyl fluorescein	Cayman	10157	5 mg/ml solution (11.81 mM) in methyl acetate, aliquotes of e.g. 100 µl should be prepared and stored at -20 °C
Hydrogen peroxide	Sigma-Aldrich	H1009	This 30% stock solution corresponds to a concentration of about 8.8 M. Further dilutions have to be freshly prepared in distilled water immediately prior to use and quantified by absorbance measurements
4-aminobenzoic acid hydrazide (4-ABAH)	Sigma-Aldrich	A41909	A first stock solution of 1 M should be prepared in DMSO a second one of 100 mM by 1:10 dilution in HBSS
DMSO	VWR chemicals	23500.26	–