트레할로스 유사체는 바이오(테크노)논리 및 생물 의학 응용 분야에서 중요한 분자로 부상하고 있습니다. 트레할로스 유사체를 효소로 합성하고 정제하기 위한 최적화된 프로토콜은 간단하고 효율적이며 빠르고 환경 친화적입니다. 마이코박테리아 검출을 위한 프로브의 신속한 생산 및 관리에 대한 적용이 입증되었습니다.
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이 논문에서
요약
초록
화학적으로 트레 할로 오스 또는 트레 할로 오스 유사체의 버전을 수정, 다른 분야들 사이 생물학, 생명 공학, 제약 과학에서 응용 프로그램을 보유하고 있습니다. 예를 들어, 검출 가능한 태그 담 트레할로스 유사체는 결핵균을 검출하기 위해 사용 된 결핵 진단 조영제로서 응용을 가질 수있다. 트레 할로 오스의 가수 분해 안정 버전 인해 비 칼로리 감미료 및 바이오 보호용 에이전트로 사용하기 위해 자신의 잠재력을 추구하고있다. 다양한 애플리케이션에 대한 이러한 부류의 화합물의 호소력에도 불구하고, 이들 전위는 그들의 제조를위한 강력한 경로의 부족으로 이루어지지 남아있다. 여기서는 화학 합성과 관련된 문제를 우회 트레할로스 유사체의 신속하고 효율적인 원스텝 생 촉매 합성 상세한 프로토콜을보고한다. 테르 모 프로테우스 속에서 TENAX에서 열 안정성 트레할로스 합성 효소 (TreT) 효소를 이용하여, 트레 할로 오스 유사체는 generat라는 될 수 있습니다에드 포도당 유사체 및 높은 수율 딘 인산 포도당에서 하나의 단계 (정량 전환까지) 15-60 분입니다. 스핀 투석 및 이온 교환 이루어져 간단하고 신속하게 비 - 크로마토 그래피 정제 프로토콜은 적은 45 분에 수용액에서 알려진 농도의 다양한 트레할로스 유사체를 제공 할 수있다. 반응 글루코오스 유사체가 남아 경우, 트레할로스 아날로그 생성물의 크로마토 그래피 정제가 수행 될 수있다. 전반적으로,이 방법은 비 화학자 효율적이고 신속한 접근 할 수있는 합성 및 트레할로스 유사체 정화용 "녹색"생 촉매 플랫폼을 제공한다. 이 방법의 적용 성을 예시하기 위해서, 합성 모든 수성 정제 프로토콜을 기술하고, 마이코 박테리아의 형광 검출을 1 시간 미만을 가져다 사용할 모두 결핵균에 트레 할로 오스 계 클릭 화학 프로브의 투여. 미래에, 우리는 OTH들 것을 구상애플리케이션 ER,이 프로토콜은 결핵 진단 트레할로스 기반 프로브의 신속한 합성을 적용 할 수있다. 같은 양전자 방출 단층 촬영 - 컴퓨터 단층 촬영 (PET-CT) 등 (예를 들면, 18 F 변성 트레할로스) 고급 임상 이미징을 위해 사용될 수있는 예를 들어, 단기 핵종 변성 트레할로스 유사체.
서론
트레할로스는 1,1-α, α-글리코 시드 결합 (도 1a)에 의해 결합 된 두 개의 글루코스 잔기로 구성된 대칭 비 환원성 이당이다. 트레할로스는 인간 및 다른 포유 동물에서 존재하지 않는 반면, 박테리아, 곰팡이, 식물, 무척추 동물 (1)에 일반적으로 발견된다. 대부분의 유기체 트레할로스의 주요 역할은 탈수 한 환경 적 스트레스로부터 보호하는 것이다. 또한, 일부 인간 병원체 셀 봉투 생합성 중재자와 면역 당지질 2의 구성에 대한 빌딩 블록으로서 트레할로스를 이용하여 결핵을 유발 결핵균 포함한 독성에 대한 트레 할로 오스를 필요로한다.
그림 1 : 트레 할로 오스 트레 할로 오스 유사체. (AX는 구조적인 변경 천연 트레 할로 오스와 부 자연스러운 트레 할로 오스 아날로그의) 구....
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프로토콜
상위 10 위 대장균 1. 발현 및 TreT의 정제
주 : TreT 발현 대장균 요청할 저자 연락하십시오 첨부 물질 전달 계약 (상위 10 위 E.로 변환 된 AraC 단백질의 제어하에 T.에 TENAX의 tret 유전자를 함유 pBAD TreT 플라스미드 19 대장균) . 다음 프로토콜은 일반적으로 약 4 ㎎ / ℓ의 단백질 수율을 제공합니다.
- 대장균을 TreT가 발현의 3 mL의 야간 문화를 준비합니다.
- 원성 육즙 (LB) 100 μg의 / ㎖의 앰피 실린을 함유하는 아가 플레이트 pBAD-TreT 발현 벡터로 형질 전환 킬 상위 10 위 대장균.
- 약 37 ℃에서 48 시간 동안 플레이트를 인큐베이션.
- 플레이트에서 하나의 식민지를 선택하고 문화 튜브에 100 μg의 / ㎖의 암피실린을 포함하는 LB 액체 배지의 3 mL를 접종.
- 37 & #에서 진탕 배양기에서 튜브를 배치176; C 하룻밤 175 RPM을 X.
- 대장균 TreT이 발현 된 단백질의 발현을 유도한다.
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결과
T. TENAX TreT 약 4 mg의 표준 단백질 발현 및 정제 기술을 사용하여 / L의 수율로 대장균을 얻었다. 단일 니켈 친 화성 크로마토 그래피 단계 (대표 FPLC 트레이스가도 4에 도시 됨) 대장균 파쇄물로부터 TreT를 정화하기에 충분했다. TreT 합성 과정에 대한 우리의 초기 출판물에 설립 된 바와 같이, 재조합 T.의 TENAX TreT는 다양한 포도당 유사체-많은의 광범위한 변환 할 수있는 것은 상업적으로 이용 가능한-에 대응하는 트레 할로 오스 유사체 높은 효율을 19입니다. 우리의 처음보고 된 프로토콜을 사용하여 당 유사체를 출발의 번호 HPLC 결정된 반응 수율을 제공하기 표 1은 기판의 TreT 성행위 및 합성을위한 적합성의 범위를 나타낸다. 아지, 플루오로, 데 옥시 등 다양.......
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토론
트레할로스 유사체는 식품 및 의약품의 보존에서 미생물 감염 (6)의 진단 및 치료에 다양한 분야에 영향을 미칠 가능성이있다. 기존의 다단계 화학 합성 방법은 (당연히 복잡한 마이코 박테리아 당지질 발생, 예를 들어) 수정의 여러 사이트와 복잡한 트레 할로 오스 유사체를 생산하는 데 유용합니다. 그러나, 이들 방법은 비교적 간단한 일 치환 트레할로스 유사체 9, 13, 14의 합성에 적용되는 경우에도 변함 길고 비효율적이다. 대안적인 합성 방법은 신속하고 효율적으로 상기 분야의 값을 가질 수있다 트레할로스 유사체의 다양한 유형을 제조하는 데 필요한. 자연 트레할로스 합성 효소를 이용 생 촉매 방식은 가장 약속을 개최합니다. 여러 트레 할로 오스 합성 경로 있지만자연에 존재하는, 우리는 여러 가지 이유로 트.......
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공개 사항
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감사의 글
이 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health, R15 AI117670)에서 B.M.S 및 P.J.W에 수여하는 보조금으로 지원되었으며, Research Corporation(20185)에서 P.J.W. L.M.M.에 수여하는 Cottrell College Scholar Award는 CMU의 학장 펠로우십(Provost's Fellowship)의 지원을 받았습니다.
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참고문헌
- Elbein, A. D., Pan, Y. T., Pastuszak, I., Carroll, D. New insights on trehalose: a multifunctional molecule. Glycobiology. 13, 17-27 (2003).
- Tournu, H., Fiori, A., Van Dijck, P. Relevance of trehalose in pathogenicity: some general rules, yet many exceptions. PLoS Pathog....
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