빠른 한 단계 효소 합성 및 트레 할로 오스 유사체의 모든 수계 정화
Summary
Trehalose analogues are emerging as important molecules for bio(techno)logical and biomedical applications. We describe an optimized protocol for enzymatically synthesizing and purifying trehalose analogues that is simple, efficient, fast, and environmentally friendly. Its application to the rapid production and administration of a probe for the detection of mycobacteria is demonstrated.
Abstract
화학적으로 트레 할로 오스 또는 트레 할로 오스 유사체의 버전을 수정, 다른 분야들 사이 생물학, 생명 공학, 제약 과학에서 응용 프로그램을 보유하고 있습니다. 예를 들어, 검출 가능한 태그 담 트레할로스 유사체는 결핵균을 검출하기 위해 사용 된 결핵 진단 조영제로서 응용을 가질 수있다. 트레 할로 오스의 가수 분해 안정 버전 인해 비 칼로리 감미료 및 바이오 보호용 에이전트로 사용하기 위해 자신의 잠재력을 추구하고있다. 다양한 애플리케이션에 대한 이러한 부류의 화합물의 호소력에도 불구하고, 이들 전위는 그들의 제조를위한 강력한 경로의 부족으로 이루어지지 남아있다. 여기서는 화학 합성과 관련된 문제를 우회 트레할로스 유사체의 신속하고 효율적인 원스텝 생 촉매 합성 상세한 프로토콜을보고한다. 테르 모 프로테우스 속에서 TENAX에서 열 안정성 트레할로스 합성 효소 (TreT) 효소를 이용하여, 트레 할로 오스 유사체는 generat라는 될 수 있습니다에드 포도당 유사체 및 높은 수율 딘 인산 포도당에서 하나의 단계 (정량 전환까지) 15-60 분입니다. 스핀 투석 및 이온 교환 이루어져 간단하고 신속하게 비 – 크로마토 그래피 정제 프로토콜은 적은 45 분에 수용액에서 알려진 농도의 다양한 트레할로스 유사체를 제공 할 수있다. 반응 글루코오스 유사체가 남아 경우, 트레할로스 아날로그 생성물의 크로마토 그래피 정제가 수행 될 수있다. 전반적으로,이 방법은 비 화학자 효율적이고 신속한 접근 할 수있는 합성 및 트레할로스 유사체 정화용 "녹색"생 촉매 플랫폼을 제공한다. 이 방법의 적용 성을 예시하기 위해서, 합성 모든 수성 정제 프로토콜을 기술하고, 마이코 박테리아의 형광 검출을 1 시간 미만을 가져다 사용할 모두 결핵균에 트레 할로 오스 계 클릭 화학 프로브의 투여. 미래에, 우리는 OTH들 것을 구상애플리케이션 ER,이 프로토콜은 결핵 진단 트레할로스 기반 프로브의 신속한 합성을 적용 할 수있다. 같은 양전자 방출 단층 촬영 – 컴퓨터 단층 촬영 (PET-CT) 등 (예를 들면, 18 F 변성 트레할로스) 고급 임상 이미징을 위해 사용될 수있는 예를 들어, 단기 핵종 변성 트레할로스 유사체.
Introduction
트레할로스는 1,1-α, α-글리코 시드 결합 (도 1a)에 의해 결합 된 두 개의 글루코스 잔기로 구성된 대칭 비 환원성 이당이다. 트레할로스는 인간 및 다른 포유 동물에서 존재하지 않는 반면, 박테리아, 곰팡이, 식물, 무척추 동물 (1)에 일반적으로 발견된다. 대부분의 유기체 트레할로스의 주요 역할은 탈수 한 환경 적 스트레스로부터 보호하는 것이다. 또한, 일부 인간 병원체 셀 봉투 생합성 중재자와 면역 당지질 2의 구성에 대한 빌딩 블록으로서 트레할로스를 이용하여 결핵을 유발 결핵균 포함한 독성에 대한 트레 할로 오스를 필요로한다.
그림 1 : 트레 할로 오스 트레 할로 오스 유사체. (AX는 구조적인 변경 천연 트레 할로 오스와 부 자연스러운 트레 할로 오스 아날로그의) 구조. biopreservation 및 bioimaging 응용 가능성이 문헌에보고 트레할로스 유사체의 (B) 예.
그것의 독특한 구조와 생리 기능에, 트레 할로 오스는 논리 바이오 (테크노)의 사용 및 생물 의학 응용 프로그램 3 상당한 관심을 받고있다. 자연 – 예에서 관찰 트레 할로 오스의 보호 특성은 눈에 띄는 기능은 4 봤어이 biopreservation 애플리케이션에 광범위한 사용을 가했다 극도의 탈수를받은 "부활"식물에서 생명을 유지하는 데 도움. 트레할로스는 핵산, 단백질, 세포 및 조직과 같은 생물학적 시료 (3)의 다양한 배열을 유지하기 위해 사용되었다. 예를 들면, 트레 할로 오스는 제약 t 다수의 안정화 첨가제로서 사용모자 여러 항암 모노클로 날 항체 (3)를 포함하여 시판된다. 뿐만 아니라, 트레 할로 오스는 식품 산업에서 감미료로 사용되며, 광범위 모두 식품 및 화장품 산업에서의 제품의 보존에 사용된다. 상용 애플리케이션의 이러한 유형에 대한 트레 할로 오스의 채용은 처음 천연 공급원 또는 합성을 통해 순수 트레할로스 벌크 수량을 얻을 수 없다는 의해 제한되었다. 그러나, 전분 트레할로스의 경제적 생산을위한 효율적인 효소 처리는 최근 널리 상업적 이용을 가했다하는 개발 된 5.
(6) 화학적으로 트레 할로 오스 유도체, 변성 (도 1b에 도시 트레할로스 유사체의 특정 예를 일반적인 구조는도 1a에 도시 된) 다양한 애플리케이션에 대한 관심 증가를 얻고, 트레할로스 유사체로 지칭. 예를 들어, 락토 트레할로스, 따라서 그것의 4 위치 수산기가 반전 된 입체 구조를 갖는다 갈락토스 치환의 글루코오스 단위 중 하나로 트레 유사체이다. 락토 트레 할로 오스 트레 할로 오스와 같은 안정화 특성을 가지고 있지만, 비 칼로리 식품 첨가물 6,7대로 매력적 장내 효소 분해에 내성이다.
트레 할로 오스 유사체에 우리 그룹의 관심은 주로 결핵균 특이 프로브 및 억제제로서 자신의 가치에 관한 것이다. 배리 데이비스 그룹은 형광 현미경 (8)의 검출을 가능하게 대사 라이브 결핵균의 세포벽을 라벨에 표시 된 FITC 케토 트레 할로 오스라는 이름의 형광 접합 케토 트레 할로 오스 아날로그를 개발. Bertozzi 연구소는 대사 탐지 할 수 이후 세포벽 레이블 및 수있는 작은 아지 트레 할로 오스 (TreAz) 유사체를 개발반사된다 클릭 화학 형광 분석 (9)를 사용. 이러한 발전은 결핵 진단 조영제로 트레할로스 기반 프로브를 사용할 수있는 가능성을 지적한다. 트레할로스 유사체는 생존하고 독성도 10,도 11,도 12에 필수적인 세균의 경로를 방해하기 때문에 그 전위에 결핵균의 억제제로 진행되고있다.
지금까지 생체 (테크노) 논리 및 생의학 애플리케이션을 위해 트레할로스 유사체를 개발하는 주요 장애물은 효율적인 합성 방법의 부족이다. 트레 할로 오스 유사체를 생산하는 두 개의 전통적인 노선들은 화학 합성에 (그림 2) 의존한다. 다른 제대로 작용 단당류 빌딩 블록으로 시작하고 화학 글리코 실화를 수행하는 동안 수반 한 경로는 자연 트레할로스 desymmetrization / 수정을 포함1,1-α, α-글리코 시드 결합을 위조. 최근 리뷰 기사 13, 14에서 논의 된 이러한 접근은 결핵균 (15)로부터 같은 sulfolipid-1과 같은 복잡한 트레 할로 오스 함유 천연 제품, 소량의 다단계 합성을 수행하기위한 유용한 입증했다. 그러나, 두 방식이 아닌 화학자 일반적으로, 시간 – 소모적 액세스 비효율적이며, 또한 환경 친화적 인 것으로 간주되지 않는다. 따라서, 트레 할로 오스 유사체의 특정 유형을 합성, 이러한 전략은 적합하지 않다.
그림 2 : 트레 할로 오스 아날로그 합성에 접근. 화학 왼쪽 그림, 트레 할로 오스 아날로그 합성에 접근, 어려운 PROTEC을 포함 다단계 절차를 사용하여기 / 탈 보호, desymmetrization 및 / 또는 당화 단계. 오른쪽 그림과 효소 합성, 입체 수용액에서 유사체를 트레 할로 오스 간단, 보호되지 않은 기판을 변환 효소 (들)를 사용합니다. 본원에보고 된 효소 프로토콜은 단일 단계로 오스 글루코오스 유사체로 유사체 및 UDP 글루코스로 변환하는 트레할로스 합성 효소 (TreT) 효소를 사용한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
트레할로스 유사체하는 효율적인 생 촉매 경로 분자 유망한 클래스의 제조, 평가하고, 프로그램을 촉진한다. 트레할로스 생산 5 상업적 효소 프로세스가 기재로서 전분을 이용하기 때문에 유사체의 합성에 적용 할 수는 없지만, 다른 생합성 경로에 존재트레 할로 오스 아날로그 합성에 이용 될 수있다 자연의 방법. 그러나, 최근 6을 검토하고이 지역에있는 연구는 제한적이었다. 한 보고서는 해당 플루오로 포도당에서 하나의 플루오로 트레 할로 오스 아날로그에 액세스 할 수 대장균 트레 할로 오스 생합성 경로에서 영감을하는 방법을 사용했다. 그러나,이 방법은 효율성과 보편성 8 제한적 세 효소 시스템을 필요로한다. 탐색 된 다른 방법은 원칙적으로 당 유사체 및 글루코스 -1- 인산 6, 16, 17에서 트레 할로 오스 유사체의 한 단계 합성을 허용 역방향에서 오스 포스 (TreP)를 사용하는 것이다. 이 접근 방식은 미래의 약속을 가질 수 있지만, 모두 반전 및 유지 이윤이 쏠쏠 히 남는는 현재 아날로그 합성 단점이있다. 예를 들어, 반전 이윤이 쏠쏠 히 남는는 엄청나게 expe의이nsive 기증자 분자 (β-D- 글루코오스 -1- 인산) 및 유지 이윤이 쏠쏠 히 남는 가난한 효소 발현 수율 / 안정성 및 제한 기판 성행위 있습니다. (효소 공학을 통해 예) 상당한 개선이 TreP 매개 아날로그 합성하기 전에 필요한 것은 실용적입니다.
현재, 트레할로스 유사체의 효소 적 합성을위한 가장 실용적인 방법은 포도당, 우리 딘 디 포스페이트 (UDP)이 단일 단계 6에서 트레 할로 오스 변환 글루코스 신타 제 (TreT) 효소를 사용하는 것이다. 최근 글루코오스 유사체 및 UDP 글루코스 (도 3) (19)로부터 트레할로스 유사체를 합성 -to 테르 모 프로테우스 속 TENAX-TreT 내열성 단방향 효소 (18)의 사용을보고 하였다. 이 효소는 합성 방향으로 동작하며 TreP 시스템에서 발견 트레할로스 열화의 문제를 피할 수있다. 이것은 단계 반응 coul1 시간 내에 완료 D 및 쉽게 사용할 글루코오스 유사체 기판 (대표 결과 표 1 참조에서 (고성능 액체 크로마토 그래피 (HPLC)에 의해 측정> 99 %까지) 트레할로스 유사체의 광범위한 다양한 고 수율로 액세스 된 섹션).
도 3 : 트레 할로 오스 유사체 TreT 촉매 작용 한 단계 합성. T.의 TENAX에서 TreT 효소는 입체 한 번에 트레 할로 오스 유사체를 형성하기 위해 쉽게 사용할 포도당 유사체 및 UDP – 포도당을 가입 할 수 있습니다. R 1 -R 4 = 변수 구조 변경, 예를 들어, 아지, 플루오로, 데 옥시, 싸이, 입체, 또는 동위 원소 라벨 변경에 대한; Y는 예를 들어 산소 또는 황, 또는 동위 원소로 표지 된 헤테로 가변 헤테로 =.
여기, 우리는 광고를 제공TreT 반응 조건에 최적화 된 대장균으로부터 발현 및 정제 TreT 포함한 TreT 합성 공정 etailed 프로토콜, 및 성상 전적으로 수행하는 개선 된 정제 방법. 이 수정 된 프로토콜은 반 예비 규모 (10 ~ 100 mg)을에 다양한 트레 할로 오스 유사체의 편법하고 효율적인 합성 및 정제 할 수 있습니다. 또한 제조 및 마이코 박테리아 세포의 급속한 형광 검출을 가능 1 시간 미만에서 마이코 박테리아에 트레할로스 기반 프로브를 관리하기위한 이러한 프로토콜의 사용을 입증한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
트레할로스 유사체는 식품 및 의약품의 보존에서 미생물 감염 (6)의 진단 및 치료에 다양한 분야에 영향을 미칠 가능성이있다. 기존의 다단계 화학 합성 방법은 (당연히 복잡한 마이코 박테리아 당지질 발생, 예를 들어) 수정의 여러 사이트와 복잡한 트레 할로 오스 유사체를 생산하는 데 유용합니다. 그러나, 이들 방법은 비교적 간단한 일 치환 트레할로스 유사체 <sup class…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by a grant from the National Institutes of Health (R15 AI117670) to B.M.S and P.J.W, as well as a Cottrell College Scholar Award from the Research Corporation (20185) to P.J.W. L.M.M. was supported by a Provost’s Fellowship from CMU.
Materials
| LB agar | Research Products International | L24021 | |
| Ampicillin sodium salt | Sigma Aldrich | A9518 | |
| Luria broth | Research Products International | L24045 | |
| Terrific Broth | Research Products International | T15050 | |
| L-(+)-Arabinose | Sigma Aldrich | A3256 | |
| Phosphate-buffered Saline | GE Healthcare | SH30256 | |
| Imidazole | Sigma Aldrich | I5513 | |
| Sodium chloride | BDH | BDH9286 | |
| Sodium phosphate, | Fisher Scientific | S374 | |
| monobasic | |||
| Syringe filter, 0.45 µm | Fisher Scientific | 09719D | |
| Protease Inhibitor mini-tablets, EDTA-free | Thermo Scientific | 88666 | |
| HisTrap HP nickel affinity column, 5 mL | GE Healthcare | 17-5248-02 | |
| TRIS base ultrapure | Research Products International | T60040 | |
| Dialysis tubing, MWCO 12–14,000 | Fisher Scientific | 21-152-16 | |
| Glucose analogues | CarboSynth, | Examples of vendors that offer numerous glucose analogues | |
| Sigma Aldrich, | |||
| Santa Cruz Biotechnology, American Radiolabeled Chemicals | |||
| 6-Azido-6-deoxy glucopyranose (6-GlcAz) | CarboSynth | MA02620 | |
| UDP-Glucose | abcam Biochemicals | ab120384 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Fisher Scientific | M33 | |
| Amicon Ultra-15 centrifugal filter unit | EMD Millipore | UFC901008 | |
| Bio-Rex RG 501-X8 mixed-bed ion-exchange resin | Bio-Rad | 444-9999 | |
| Extra-Fine Bio-Gel P2 media | Bio-Rad | 150-4118 | |
| Glass-backed silica gel thin-layer chromatography plates | EMD Millipore | 1056280001 | |
| n-Butanol | Fisher Scientific | A399 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | S25310A | |
| Sulfuric acid | Fisher Scientific | A300 | |
| Acetonitrile | EMD Millipore | AX0145 | |
| Deuterium oxide, 99.8% | Acros Organics | 351430075 | |
| Aminopropyl HPLC column | Sigma Aldrich | 58338 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | 5470 | |
| Para-formaldehyde | Ted Pella | 18505 | |
| Alkyne-488 | Sigma Aldrich | 761621 | |
| Sodium ascorbate | Sigma Aldrich | A7631 | |
| Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA) | Click Chemistry Tools | 1061 | |
| tert-Butanol | Sigma Aldrich | 360538 | |
| Dimethylsulfoxide | Sigma Aldrich | W387520 | |
| Copper(II) sulfate | Sigma Aldrich | C1297 | |
| Fluoromount-G mounting medium | Southern Biotechnology | 10001 |
References
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