जीन या ड्रग थेरेपी में उपयोग के लिए लक्ष्य निर्धारण एचआईवी -1 उत्पादन प्रभावकारिता और आरएनए की विषाक्तता का मूल्यांकन
Summary
Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.
Abstract
Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.
Introduction
वर्तमान एचआईवी -1 उपचार की एक सीमा है कि वे लंबे समय से रोग प्रगति को रोकने के लिए प्रशासित किया जाना चाहिए। एचआईवी -1 प्रतिरोधी टी लिम्फोसाइट, या hematopoietic स्टेम कोशिकाओं के प्रत्यारोपण, संभावित ड्रग थेरेपी 1,2 के अभाव में एचआईवी -1 प्रतिकृति की लंबी अवधि के नियंत्रण प्रदान करने के लिए है और यह भी एक प्रभावी दृष्टिकोण एक एचआईवी -1 इलाज प्राप्त करने के लिए हो सकता है 3। एक तरह से एचआईवी -1 प्रतिकृति के लिए प्रतिरोधी कोशिकाओं को प्रस्तुत करने के लिए एक ऑटोलॉगस प्रत्यारोपण 4 के दौरान एक या एक से अधिक जीन एक संक्रमित व्यक्ति की कोशिकाओं में विरोधी एचआईवी -1 आरएनए या पेप्टाइड्स के लिए कोडिंग डालने के लिए है। कई उम्मीदवार विरोधी एचआईवी -1 जीन किसी भी एक जीन को एचआईवी -1 प्रतिरोध के विकास को रोकने के लिए दो या तीन 5 6 के संयोजन में कुछ में प्रवेश क्लिनिकल परीक्षण के साथ डिजाइन किया गया है।
एंटी एचआईवी -1 आरएनए उनके कम संभावित प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया प्रकाश में लाना करने के कारण और क्योंकि वे संयोजन जीन थेरेपी के लिए शीर्ष उम्मीदवारों के बीच में हैंबहुत ही कम जीन दृश्यों से लिखित हैं। कुछ विरोधी एचआईवी -1 आरएनए वायरल प्रविष्टि और एकीकरण को लक्षित करने के लिए डिजाइन किया गया है। हालांकि, ज्यादातर विरोधी एचआईवी -1 आरएनए वायरल जीवन चक्र में बाद के एकीकरण कदम (चित्रा 1) लक्ष्य। पोस्ट-एकीकरण अवरोधकों ऐसे ribozymes 7, 8 और shRNAs U1i RNAs 9 के रूप में एचआईवी -1 नियामक प्रोटीन गूंथना या रेव 1, और antisense आधारित RNAs को लक्षित, एचआईवी -1 शाही सेना में अलग अलग साइटों को लक्षित, प्रलोभन RNAs शामिल हैं। तरीके कि विरोधी एचआईवी -1 आरएनए की प्रभावकारिता तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया गया है जीन उम्मीदवार RNAs के लिए कोडिंग और क्षणिक उम्मीदवार RNAs व्यक्त plasmids के साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं में वायरल उत्पादन और एक एचआईवी -1 प्लाज्मिड अभिव्यक्ति को मापने के साथ transduced कोशिकाओं में वायरल प्रतिकृति की निगरानी में शामिल 10 -13। हम पहले से स्क्रीन करने के लिए एचआईवी -1 नई ribozyme लक्ष्य साइटों 13-15 के लिए शाही सेना एक एचआईवी -1 उत्पादन परख का इस्तेमाल किया है। इन विधियों के बाद से एक शाही सेना के प्रारूप अनुकूलन करने के लिए परिष्कृत किया गया हैहस्तक्षेप अणु एक shRNA के रूप में प्लास्मिड डीएनए से व्यक्त या एक सिंथेटिक siRNA 16 के रूप में दिया जाता है। परख मानव भ्रूण गुर्दे (HEK) 293T कोशिकाओं से परिपक्व वायरस के उत्पादन के उपाय, और अवरोधकों कि एचआईवी -1 प्रतिकृति चक्र में बाद के एकीकरण कदम लक्ष्य (चित्रा 1) के प्रभाव की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। अवरोधकों कि पूर्व एकीकरण कदम लक्ष्य के लिए, इस तरह के एक TZM बीएल सेल संक्रामकता परख 17 के रूप में वैकल्पिक assays एंटीवायरल प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने की जरूरत है।
क्लिनिक में विरोधी एचआईवी -1 आरएनए के वितरण के लिए प्रमुख सुरक्षा चिंताओं मानव आरएनए या प्रोटीन, और सहज प्रतिरक्षा सेंसर की सक्रियता पर संभावित बंद लक्ष्य प्रभाव शामिल हैं। विरोधी एचआईवी -1 siRNAs की विषाक्तता का मूल्यांकन करने के लिए, हम अलग अलग सेल लाइनों 16 में एक सेल व्यवहार्यता परख का इस्तेमाल किया है। हम भी डबल असहाय शाही सेना प्रतिरक्षा सेंसर की सक्रियता को मापा, आरएनए सक्रिय प्रोटीन काइनेज आर (PKR) और रिसेप्टर 3 (TLR3) की तरह टोल, साथ ही पूर्वइंटरफेरॉन की अभिव्यक्ति जीन, ADAR1 P150 को प्रेरित किया। ये assays पुष्टि करने के लिए कि विरोधी एचआईवी -1 आरएनए की प्रभावकारिता सेल व्यवहार्यता या प्रतिरक्षा सेंसर सक्रियण पर अप्रत्यक्ष प्रभाव के कारण नहीं है इस्तेमाल किया जा सकता है। उन्होंने यह भी आगे विकास से संभावित विषाक्तता के साथ उम्मीदवार RNAs को छोड़कर में उपयोगी होते हैं।
निम्नलिखित प्रोटोकॉल में, प्रक्रियाओं नई चिकित्सकीय RNAs की पहचान करने और अनुकूलन मौजूदा वालों के प्रारूप में वर्णित किया जाता है। तरीकों एचआईवी -1 प्रतिकृति की स्क्रीनिंग आरएनए आधारित पोस्ट-एकीकरण अवरोधकों के लिए उपयोगी होते हैं और इस तरह के वायरल शाही सेना 18 या CRISPR की रेव मध्यस्थता निर्यात को निशाना छोटे अणुओं के रूप में अन्य के बाद एकीकरण निरोधक, स्क्रीन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है / डिजाइन किए कैस सिस्टम एकीकृत लक्षित करने एचआईवी -1 डीएनए 19।
Protocol
Representative Results
Discussion
एचआईवी -1 उत्पादन परख वर्णित HEK293T कोशिकाओं का उपयोग कर (चित्रा 2) का प्रदर्शन किया गया था और प्रभावी ribozyme 13 के लिए स्क्रीन करने के लिए एचआईवी -1 शाही सेना, shRNA 10,29, siRNA 30, और U1i आरएनए 11,31 लक्ष्य साइ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यहाँ प्रस्तुत काम के स्वास्थ्य अनुसंधान (CIHR) की कनाडा के संस्थानों द्वारा समर्थित किया गया (अनुदान DCB-120266, 133377 पीपीपी और एजी को HBF-348967)।
Materials
| DMEM HyClone | GE Healthcare | SH30243.01 | |
| FBS HyClone | GE Healthcare | SH30396.03 | |
| Penicillin/Streptomycin Gibco | Thermo Fisher | 15140-122 | |
| Cell culture plates, 96 well, 24 well, 6 well. | Corning | 353075, 353047, 353043 | |
| Micro tubes Axygen | Corning | 311-08-051 | |
| Low molecular weight Poly I:C | InvivoGen | 3182-29-6 | |
| DharmaFECT-1 | Dharmacon | T-2001-01 | transfection reagent for synthetic RNAs |
| TransIT-LT1 | Mirus | MIR 2300 | transfection reagent for RNA expression plasmids |
| Nonidet P40 (NP-40) | USB | 19628 | |
| [32P]dTTP | Perkin Elmer | BLU505H | |
| poly(A) RNA template | Sigma-Aldrich | 10108626001 | |
| oligo(dT)12-18 DNA primer | Thermo Fisher | 18418-012 | |
| DEAE filtermat paper | Perkin Elmer | 1450-522 | |
| Microplate scintillation counter | Perkin Elmer | 1450-024 | |
| MTT | Sigma-Aldrich | M-2128 | |
| DPBS HyClone | GE Healthcare | SH30028.02 | |
| Microplate spectrophotometer | Bio-rad | 1706930 | |
| Lysis buffer tablets | Roche | 4693159001, 4906837001 | protease and phosphatase inhibitors |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Bradford reagent | Bio-rad | 500-0006 | |
| Gel running chamber | Hoefer | SE600 | |
| Semi-dry transfer cell | Bio-rad | 1703940 | |
| Protein ladder EZ-Run | Thermo Fisher | BP3603-500 | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-rad | 162-0094 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9647-1006 | |
| Antibody stripping solution | Millipore | 2504 | |
| ECL – Pierce | Thermo Fisher | PI32106 | |
| ADAR1 antibody | from Dr. B.L. Bass | ||
| phospho-T446-PKR antibody | Abcam | ab32036 | |
| phospho-S396-IRF3 antibody | Cell Signaling | 4947 | |
| PKR antibody | from Dr. A. Hovanessian | ||
| IRF3 antibody | Cell Signaling | 11904 | |
| Actin antibody | Millipore | MAB1501 | |
| Peroxidase-labeled goat anti-rabbit | KPL | 474-1506 | |
| Peroxidase-labeled goat anti-mouse | KPL | 474-1806 | |
| Ponceau S | Sigma-Aldrich | 6226-79-5 |
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