בידוד של ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה עבור Non-קידוד RNA קטנים כימות
Summary
This protocol describes the isolation and quantification of high-density lipoprotein small RNAs.
Abstract
המגוון של RNAs ללא קידוד קטן (Srna) היא מתרחבת במהירות ותפקידיהם בתהליכים ביולוגיים, כולל ויסות הגנים, הם מתעוררים. הדבר המעניין ביותר, sRNAs הם גם מצאו מחוץ לתאים ו נמצאים ביציבות בכל נוזלים ביולוגיים. ככזה, sRNAs התאי מייצג סוג רומן של סמנים ביולוגיים למחלות קרובות לוודאי מעורב איתות תא ורשתות תקשורת בין תאית. כדי להעריך את הפוטנציאל שלהם לשמש כסמנים ביולוגיים, sRNAs ניתן לכמת בפלסמה, בשתן, ונוזלים אחרים. אף על פי כן, כדי להבין את ההשפעה מלאה של sRNAs תאי כאותות האנדוקרינית, חשוב לקבוע אילו ספקים מעבירים והגנה אותם הנוזלים ביולוגיים (למשל, פלזמה), אשר תאים ורקמות לתרום ברכות Srna תאיות, ותאים ורקמות מסוגלות קבלה וניצול Srna התאי. כדי להשיג מטרות אלו, חשוב לבודד אוכלוסיות טהורות מאוד של ספקים תאייםעבור פרופיל וכימות Srna. אנחנו הוכחנו בעבר כי ליפופרוטאינים, במיוחד ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה (HDL), להעביר מייקרו RNA הפונקציונלי (מירנה) בין תאים ו- HDL-miRNAs הם שינו באופן משמעותי מחלה. כאן, פרט לנו פרוטוקול חדש אשר מנצל בידוד HDL בד בבד עם ultracentrifugation צפיפות שיפוע (DGUC) ומהר-חלבון נוזלי כרומטוגרפיה (FPLC) להשיג HDL טהור מאוד עבור פרופיל במורד וכימות של כל sRNAs, כולל miRNAs, הן באמצעות גבוהה רצף -throughput וגישות PCR בזמן אמת. פרוטוקול זה יהיה משאב יקר ערך עבור החקירה של sRNAs על HDL.
Introduction
RNA הקטן ללא קידוד התאי (sRNAs) מייצג סוג חדש של סמנים ביולוגיים למחל מטרות טיפוליות פוטנציאליות להקל סביר תא אל תא תקשורת 1. הסוג למד הנרחב ביותר של Srna הוא מייקרו-רנ"א (מירנה) שהם כ 22 nts באורך מעובדים מצורות מבשרות עוד תעתיק עיקרי 2. miRNAs הודגם שלאחר יעתיק לווסת ביטוי גנים באמצעות דיכוי תרגום חלבון והאינדוקציה של שפלת mRNA 2. אף על פי כן, miRNAs הוא רק אחד מסוגים רבים של sRNAs; כמו sRNAs ניתן ביקע מן tRNAs הורה (sRNAs הנגזרות tRNA, TDR), RNAs גרעיני קטן (Srna הנגזרות sRNAs, sndRNA), RNAs nucleolar קטן (snoRNA הנגזרות sRNAs, snRNA), RNAs ריבוזומלי (rRNA הנגזרות sRNAs, RDR RNAs, Y) (yDR), ו RNAs השונה אחרת 1. הנה כמה דוגמאות של sRNAs הרומן האלה דווחו לתפקד דומה miRNAs; לעומת זאת, פו הביולוגיnctions של רבי sRNAs אלה עדיין לא נקבע, אף תפקידי ויסות גנים צפויים 3-6. הדבר המעניין ביותר, miRNAs ו sRNAs אחרים נוכחים ביציבות בנוזלי תאיים, כולל רוק, פלזמה, שתן, ומרה. sRNAs התאי מוגן סביר מן RNases דרך התקשרותן עם שלפוחית תאית (EV), ליפופרוטאינים, ו / או מתחמי ribonucleoprotein תאיים.
בעבר, דיווחנו ליפופרוטאינים כי, כלומר ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה (HDL), miRNAs תחבורה בפלסמה 7. במחקר זה, HDL בודדו בשיטה סדרתית של ultracentrifugation צפיפות שיפוע (DGUC), כרומטוגרפיה נוזלית מהיר חלבון (סינון ג'ל כרומטוגרפיה בגודל הדרה, FPLC), ו כרומטוגרפיה זיקה (אנטי-אפוליפופרוטאין AI (apoA-לי immunoprecipitation) 7). שימוש בשני מערכים בצפיפות נמוכה בזמן אמת מבוססי PCR מבחני מירנה בודדים, רמות מירנה כומתו על HDL מבודד לרפאעמך ונושאים hypercholesterolemic 7. בגישה זו, הצלחנו פרופיל miRNAs ולכמת miRNAs הספציפי בהכנות HDL טהורות מאוד. מאז 2011, קבענו כי למרות כרומטוגרפיה זיקת משפר טוהרת HDL, רווית נוגדן מגבילה במידה ניכרת תשואה, והוא יכול להיות עלות אוסרני. נכון לעכשיו, הפרוטוקול שלנו ממליץ על שיטת טנדם רציפי שני שלבים של DGUC ואחריו FPLC, שיוצרים גם דגימות HDL באיכות גבוהה עבור בידוד RNA למטה זרם וכימות Srna. בשל ההתקדמות רצף תפוקה גבוהה של sRNAs (sRNAseq), למשל, miRNAs, והגברת המודעות של מעמדות אחרים שאינם מירנה Srna, sRNAseq הוא המדינה- of-the-art הנוכחי פרופיל מירנה Srna. ככזה, הפרוטוקול שלנו ממליץ miRNAs לכימות sRNAs אחר על דגימות HDL באמצעות sRNAseq. אף על פי כן, RNA הכולל מבודד HDL יכול לשמש גם לכמת miRNAs פרט sRNAs אחר או לאמת תוצאות sRNAseq באמצעות בזמן אמת PCRpproaches. כאן אנו מתארים בפרוטרוט פרוטוקול לאיסוף, טיהור, כימות, ניתוח נתונים, ואימות של sRNAs HDL טהור מאוד.
המטרה הכללית של מאמר זה היא להוכיח את ההיתכנות ואת תהליך של כימות Srna ב- HDL טהור מאוד מבודד מפלסמה אנושית.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה נועד לכמת miRNAs ו sRNAs אחרים על ידי רצף תפוקה גבוהה או בזמן אמת PCR על HDL טהור מאוד. כמו בכל גישה, שיקולים מיוחדים יש לתת לכל שלב בתהליך של HDL מטהר RNA ואז לכימות sRNAs. פרוטוקול זה מיועד פרויקטים החל ≥ 2 מ"ל של הפלזמה. אף על פי כן, ניתוחי RNA באיכות גבוהה ניתן להשלים בה?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by awards from the National Institutes of Health, National Heart, Lung and Blood Institute to K.C.V. HL128996, HL113039, and HL116263. This work was also supported by awards from the American Heart Association to K.C.V. CSA2066001, D.L.M POST26630003, and R.M.A. POST25710170.
Materials
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A99839 | Optima XPN-80 |
| Ultracentrifuge Rotor | Beckman Coulter | 331362 | SW-41Ti |
| AKTA Pure FPLC System | GE Healthcare | 29018224 | |
| 3X FPLC Superdex 200 Increase Columns In-line | GE Healthcare | 28990944 | 10/300 gl |
| SynergyMx | BioTek Instruments | 7191000 | |
| Tabletop centrifuge | Thermo Scientific | 75004525 | Sorvall ST40R |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 22629867 | 5417R (purchased through USA Scientific) |
| Microfuge | USA Scientific | 2631-0006 | |
| PippenPrep | Sage Science | PIP0001 | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2938B | |
| High Sensitivity DNA Assay | Agilent | 5067-4626 | |
| Sequencing Library qPCR Quantification Kit | Illumina | SY-930-1010 | |
| ProFlex Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4484073 | |
| QuantStudio 12k Flex | Applied Biosystems | 4471134 | |
| EpMotion Robot | Eppendorf | 960000111 | 5070 |
| Ultra-clear centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344059 | |
| Potassium Bromide | Fisher Chemicals | P205-500 | |
| 15 mL conical tube | Thermo Scientific | 339650 | |
| Micro-centrifugal filters 0.45µm | Millipore | UFC30HV00 | |
| Micro-centrifugal filters 0.22µm | Millipore | UFC30GV00 | |
| miRNAEasy Total RNA Isolation Kits | Qiagen | 217004 | |
| Total Cholesterol colormetric kit | Cliniqa (Raichem) | R80035 | |
| 10,000 m.w. cut-off centrifugation filter | Amicon | UFC801024 | purchased through Millipore |
| PCR strip tubes | Axygen | PCR-0208-C | purchased through Fisher |
| microRNA RT kit | Life Technologies | 4366597 | For 1000 reactions |
| PCR master mix | Life Technologies | 4440041 | 50 mL bottle |
| Pierce BCA kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Clean and Concentrator Kit | Zymo | D4014 | |
| Dialysis tubing | Spectrum Labs | 132118 | purchased through Fisher |
| bcl2fastq2 | Illumina | n/a | Software |
| Cutadapt | https://github.com/marcelm/cutadapt | n/a | Software |
| NGSPERL | github.com/shengqh/ngsperl | n/a | Software |
| CQSTools | github.com/shengqh/CQS.Tools | n/a | Software |
| Bowtie 1.1.2 | http://bowtie-bio.sourceforge.net | n/a | Software |
| GeneSpringGX13.1.1 | Agilent | n/a | Software |
References
- Vickers, K. C., Roteta, L. A., Hucheson-Dilks, H., Han, L., Guo, Y. Mining diverse small RNA species in the deep transcriptome. Trends Biochem Sci. 40, 4-7 (2015).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-297 (2004).
- Haussecker, D., et al. Human tRNA-derived small RNAs in the global regulation of RNA silencing. RNA. 16, 673-695 (2010).
- Li, Z., et al. Extensive terminal and asymmetric processing of small RNAs from rRNAs, snoRNAs, snRNAs, and tRNAs. Nucleic Acids Res. 40, 6787-6799 (2012).
- Martens-Uzunova, E. S., Olvedy, M., Jenster, G. Beyond microRNA–novel RNAs derived from small non-coding RNA and their implication in cancer. Cancer Lett. 340, 201-211 (2013).
- Maute, R. L., et al. tRNA-derived microRNA modulates proliferation and the DNA damage response and is down-regulated in B cell lymphoma. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 1404-1409 (2013).
- Vickers, K. C., Palmisano, B. T., Shoucri, B. M., Shamburek, R. D., Remaley, A. T. MicroRNAs are transported in plasma and delivered to recipient cells by high-density lipoproteins. Nat Cell Biol. 13, 423-433 (2011).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem. 150, 76-85 (1985).
- Chen, C., Khaleel, S. S., Huang, H., Wu, C. H. Software for pre-processing Illumina next-generation sequencing short read sequences. Source Code Biol Med. 9, 8 (2014).
- Vickers, K. C., Remaley, A. T. Lipid-based carriers of microRNAs and intercellular communication. Curr Opin Lipidol. 23, 91-97 (2012).
- Greening, D. W., Xu, R., Ji, H., Tauro, B. J., Simpson, R. J. A protocol for exosome isolation and characterization: evaluation of ultracentrifugation, density-gradient separation, and immunoaffinity capture methods. Methods Mol Biol. 1295, 179-209 (2015).
- Sung, B. H., Ketova, T., Hoshino, D., Zijlstra, A., Weaver, A. M. Directional cell movement through tissues is controlled by exosome secretion. Nat Commun. 6, 7164 (2015).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25, 402-408 (2001).
- Jung, R., Lubcke, C., Wagener, C., Neumaier, M. Reversal of RT-PCR inhibition observed in heparinized clinical specimens. Biotechniques. 23, (1997).
- Johnson, M. L., Navanukraw, C., Grazul-Bilska, A. T., Reynolds, L. P., Redmer, D. A. Heparinase treatment of RNA before quantitative real-time RT-PCR. Biotechniques. 35, 1140-1142 (2003).
- Garcia, M. E., Blanco, J. L., Caballero, J., Gargallo-Viola, D. Anticoagulants interfere with PCR used to diagnose invasive aspergillosis. J Clin Microbiol. 40, 1567-1568 (2002).
- Yokota, M., Tatsumi, N., Nathalang, O., Yamada, T., Tsuda, I. Effects of heparin on polymerase chain reaction for blood white cells. J Clin Lab Anal. 13, 133-140 (1999).
- Bai, X., et al. Predictive value of quantitative PCR-based viral burden analysis for eight human herpesviruses in pediatric solid organ transplant patients. J Mol Diagn. 2, 191-201 (2000).
- McShine, R. L., Sibinga, S., Brozovic, B. Differences between the effects of EDTA and citrate anticoagulants on platelet count and mean platelet volume. Clin Lab Haematol. 12, 277-285 (1990).
- Fichtlscherer, S., et al. Circulating microRNAs in patients with coronary artery disease. Circ Res. 107, 677-684 (2010).
- Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. MicroRNA profiling: approaches and considerations. Nat Rev Genet. 13, 358-369 (2012).
- Kirschner, M. B., et al. Haemolysis during sample preparation alters microRNA content of plasma. PLoS One. 6, e24145 (2011).
- Kannan, M., Atreya, C. Differential profiling of human red blood cells during storage for 52 selected microRNAs. Transfusion. 50, 1581-1588 (2010).
- Chen, S. Y., Wang, Y., Telen, M. J., Chi, J. T. The genomic analysis of erythrocyte microRNA expression in sickle cell diseases. PLoS One. 3, e2360 (2008).
- Balzano, F., et al. miRNA Stability in Frozen Plasma Samples. Molecules. 20, 19030-19040 (2015).
- Redgrave, T. G., Roberts, D. C., West, C. E. Separation of plasma lipoproteins by density-gradient ultracentrifugation. Anal Biochem. 65, 42-49 (1975).
- Cheung, M. C., Wolf, A. C. Differential effect of ultracentrifugation on apolipoprotein A-I-containing lipoprotein subpopulations. J Lipid Res. 29, 15-25 (1988).
- Kunitake, S. T., Kane, J. P. Factors affecting the integrity of high density lipoproteins in the ultracentrifuge. J Lipid Res. 23, 936-940 (1982).
- Laurent, L. C., et al. Meeting report: discussions and preliminary findings on extracellular RNA measurement methods from laboratories in the NIH Extracellular RNA Communication Consortium. J Extracell Vesicles. 4, 26533 (2015).
