गैर-कोडिंग लघु शाही सेना मात्रा के लिए उच्च घनत्व लिपो प्रोटीन का अलगाव
Summary
This protocol describes the isolation and quantification of high-density lipoprotein small RNAs.
Abstract
छोटे गैर-कोडिंग RNAs की विविधता (sRNA) तेजी से विस्तार हो रहा है और जीन विनियमन सहित जैविक प्रक्रियाओं में उनकी भूमिकाओं में उभर रहे हैं। सबसे दिलचस्प है, sRNAs भी कोशिकाओं के बाहर पाया और स्थिरतापूर्वक सभी जैविक तरल पदार्थ में मौजूद हैं। जैसे, बाह्य sRNAs रोग बायोमार्कर के एक उपन्यास वर्ग का प्रतिनिधित्व करते हैं और संभावना सेल संकेतन और कहनेवाला संचार नेटवर्क में शामिल कर रहे हैं। बायोमार्कर के रूप में उनकी क्षमता का आकलन करने के लिए, sRNAs प्लाज्मा, मूत्र, और अन्य तरल पदार्थ में मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। फिर भी, पूरी तरह से अंत: स्रावी संकेतों के रूप में बाह्य sRNAs के प्रभाव को समझने के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि कौन कौन से वाहक परिवहन और उन्हें जैविक तरल पदार्थ (जैसे, प्लाज्मा) है, जो कोशिकाओं और ऊतकों बाह्य sRNA पूल के लिए योगदान में रक्षा कर रहे हैं, और कोशिकाओं और ऊतकों में सक्षम है के स्वीकार करने और बाह्य sRNA का उपयोग। इन लक्ष्यों को पूरा करने के लिए, यह बाह्य वाहकों के अत्यधिक शुद्ध आबादी को अलग करने के लिए महत्वपूर्ण हैsRNA रूपरेखा और मात्रा का ठहराव के लिए। हम पहले से दिखा दिया है कि लिपो प्रोटीन, विशेष रूप से उच्च घनत्व लिपो प्रोटीन (एचडीएल), कोशिकाओं और एचडीएल miRNAs के बीच कार्यात्मक microRNAs (miRNA) काफी रोग में बदल रहे हैं परिवहन। यहाँ, हम विस्तार एक नए प्रोटोकॉल है कि घनत्व ढाल ultracentrifugation (DGUC) और तेजी से प्रोटीन तरल क्रोमैटोग्राफी (FPLC) के साथ मिलकर एचडीएल अलगाव का इस्तेमाल अत्यधिक शुद्ध एचडीएल नीचे की ओर रूपरेखा और miRNAs सहित सभी sRNAs, की मात्रा का ठहराव के लिए प्राप्त करने के लिए, दोनों उच्च का उपयोग कर -throughput अनुक्रमण और वास्तविक समय पीसीआर दृष्टिकोण। इस प्रोटोकॉल एचडीएल पर sRNAs की जांच के लिए एक मूल्यवान संसाधन हो जाएगा।
Introduction
कोशिकी गैर-कोडिंग छोटे RNAs (sRNAs) रोग बायोमार्कर और संभावित चिकित्सीय लक्ष्यों का एक नया वर्ग का प्रतिनिधित्व करते हैं और संभावना सेल करने वाली कोशिका संचार 1 की सुविधा। SRNA का सबसे व्यापक रूप से अध्ययन प्रकार microRNAs (miRNA) जो लंबाई में लगभग 22 एनटीएस हैं और लंबे समय तक अग्रदूत रूपों और प्राथमिक टेप 2 से कार्रवाई कर रहे हैं कर रहे हैं। miRNAs पोस्ट-transcriptionally प्रोटीन अनुवाद और mRNA गिरावट 2 की प्रेरण के दमन के माध्यम से जीन अभिव्यक्ति को विनियमित करने के लिए प्रदर्शन किया गया है। फिर भी, miRNAs सिर्फ sRNAs के कई प्रकार के होते हैं; के रूप में sRNAs माता पिता tRNAs (tRNA व्युत्पन्न sRNAs, टीडीआर), छोटे परमाणु आरएनए (sRNA व्युत्पन्न sRNAs, sndRNA), छोटे nucleolar आरएनए (snoRNA व्युत्पन्न sRNAs, snRNA), ribosomal RNAs से चिपके रहते जा सकता है (rRNA व्युत्पन्न sRNAs, आरडीआर ), वाई आरएनए (yDR), और अन्य विविध RNAs 1। इन उपन्यास sRNAs के कुछ उदाहरण miRNAs के समान कार्य करने के लिए सूचित किया गया है; हालांकि, जैविक फूइन sRNAs से कई की nctions, निर्धारित किया जाना बना रहता है, हालांकि जीन विनियमन में भूमिका होने की संभावना 3-6 कर रहे हैं। सबसे दिलचस्प है, miRNAs और अन्य sRNAs लार, प्लाज्मा, मूत्र, और पित्त सहित बाह्य तरल पदार्थ, में स्थिरतापूर्वक मौजूद हैं। कोशिकी sRNAs संभावना बाह्य पुटिकाओं (ईवी), लिपो प्रोटीन, और / या बाह्य ribonucleoprotein परिसरों के साथ अपने सहयोग के माध्यम से RNases से सुरक्षित हैं।
इससे पहले, हम उस लिपो प्रोटीन, अर्थात् उच्च घनत्व लिपो प्रोटीन (एचडीएल), प्लाज्मा 7 में परिवहन miRNAs की सूचना दी। इस अध्ययन में, एचडीएल घनत्व ढाल ultracentrifugation के एक अनुक्रमिक विधि (DGUC), तेजी से प्रोटीन तरल क्रोमैटोग्राफी (आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी जेल निस्पंदन, FPLC), और आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी (विरोधी apolipoprotein ऐ (apoA I) immunoprecipitation का उपयोग कर अलग कर रहे थे ) 7। दोनों वास्तविक समय पीसीआर आधारित कम घनत्व सरणियों और व्यक्तिगत miRNA assays का उपयोग करना, miRNA के स्तर पर एचडीएल मात्रा निर्धारित किया गया चंगा से अलगतेरा और hypercholesterolemic विषयों 7। इस दृष्टिकोण का प्रयोग, हम miRNAs प्रोफ़ाइल और अत्यधिक शुद्ध एचडीएल तैयारी में विशिष्ट miRNAs यों करने में सक्षम थे। 2011 के बाद से, हमने पाया कि हालांकि आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी एचडीएल पवित्रता को बढ़ाता है, एंटीबॉडी संतृप्ति बहुत उपज को सीमित करता है, और लागत निषेधात्मक जा सकता है। वर्तमान में, हमारे प्रोटोकॉल DGUC की एक दो कदम अनुक्रमिक मिलकर विधि FPLC है, जो भी डाउन स्ट्रीम शाही सेना अलगाव और sRNA मात्रा का ठहराव के लिए उच्च गुणवत्ता एचडीएल नमूने पैदा करता है के द्वारा पीछा सिफारिश की। SRNAs (sRNAseq), उदाहरण के लिए, miRNAs की उच्च throughput अनुक्रमण, और अन्य गैर miRNA sRNA कक्षाओं की वृद्धि की जागरूकता में हाल के अग्रिमों के कारण, sRNAseq है वर्तमान राज्य के अत्याधुनिक miRNA और sRNA रूपरेखा में। जैसे, हमारे प्रोटोकॉल बढ़ाता miRNAs और sRNAseq का उपयोग कर एचडीएल नमूनों पर अन्य sRNAs की सिफारिश की। बहरहाल, कुल शाही सेना एचडीएल से अलग भी व्यक्ति miRNAs और अन्य sRNAs यों या वास्तविक समय पीसीआर एक का उपयोग कर sRNAseq परिणाम को मान्य करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकताpproaches। यहाँ हम विस्तार से संग्रह, शुद्धि, मात्रा का ठहराव, डेटा विश्लेषण, और अत्यधिक शुद्ध एचडीएल sRNAs के सत्यापन के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है।
इस पत्र के समग्र लक्ष्य मानव प्लाज्मा से अलग अत्यधिक शुद्ध एचडीएल में व्यवहार्यता और sRNA मात्रा का ठहराव करने की प्रक्रिया का प्रदर्शन है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल अत्यधिक शुद्ध एचडीएल पर उच्च throughput अनुक्रमण या वास्तविक समय पीसीआर द्वारा miRNAs और अन्य sRNAs यों बनाया गया है। किसी भी दृष्टिकोण के साथ के रूप में, विशेष कारणों से सफ़ाई एचडीएल और शाही सेना की प्?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by awards from the National Institutes of Health, National Heart, Lung and Blood Institute to K.C.V. HL128996, HL113039, and HL116263. This work was also supported by awards from the American Heart Association to K.C.V. CSA2066001, D.L.M POST26630003, and R.M.A. POST25710170.
Materials
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A99839 | Optima XPN-80 |
| Ultracentrifuge Rotor | Beckman Coulter | 331362 | SW-41Ti |
| AKTA Pure FPLC System | GE Healthcare | 29018224 | |
| 3X FPLC Superdex 200 Increase Columns In-line | GE Healthcare | 28990944 | 10/300 gl |
| SynergyMx | BioTek Instruments | 7191000 | |
| Tabletop centrifuge | Thermo Scientific | 75004525 | Sorvall ST40R |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 22629867 | 5417R (purchased through USA Scientific) |
| Microfuge | USA Scientific | 2631-0006 | |
| PippenPrep | Sage Science | PIP0001 | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2938B | |
| High Sensitivity DNA Assay | Agilent | 5067-4626 | |
| Sequencing Library qPCR Quantification Kit | Illumina | SY-930-1010 | |
| ProFlex Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4484073 | |
| QuantStudio 12k Flex | Applied Biosystems | 4471134 | |
| EpMotion Robot | Eppendorf | 960000111 | 5070 |
| Ultra-clear centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344059 | |
| Potassium Bromide | Fisher Chemicals | P205-500 | |
| 15 mL conical tube | Thermo Scientific | 339650 | |
| Micro-centrifugal filters 0.45µm | Millipore | UFC30HV00 | |
| Micro-centrifugal filters 0.22µm | Millipore | UFC30GV00 | |
| miRNAEasy Total RNA Isolation Kits | Qiagen | 217004 | |
| Total Cholesterol colormetric kit | Cliniqa (Raichem) | R80035 | |
| 10,000 m.w. cut-off centrifugation filter | Amicon | UFC801024 | purchased through Millipore |
| PCR strip tubes | Axygen | PCR-0208-C | purchased through Fisher |
| microRNA RT kit | Life Technologies | 4366597 | For 1000 reactions |
| PCR master mix | Life Technologies | 4440041 | 50 mL bottle |
| Pierce BCA kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Clean and Concentrator Kit | Zymo | D4014 | |
| Dialysis tubing | Spectrum Labs | 132118 | purchased through Fisher |
| bcl2fastq2 | Illumina | n/a | Software |
| Cutadapt | https://github.com/marcelm/cutadapt | n/a | Software |
| NGSPERL | github.com/shengqh/ngsperl | n/a | Software |
| CQSTools | github.com/shengqh/CQS.Tools | n/a | Software |
| Bowtie 1.1.2 | http://bowtie-bio.sourceforge.net | n/a | Software |
| GeneSpringGX13.1.1 | Agilent | n/a | Software |
References
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