이 프로토콜은 고밀도 지단백질 small RNA의 분리 및 정량화를 설명합니다.
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방법 논문
작은 RNA 정량 비는 코딩을위한 고밀도 지방 단백질의 분리
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
작은 비 코딩 RNA를의 다양성 (스르나)는 급속하게 확장되고 유전자 조절을 포함한 생물학적 과정에서 자신의 역할이 부상하고있다. 가장 흥미로운 sRNAs은 세포의 외부 발견하고 안정적으로 모든 생물학적 체액에 존재한다. 따라서, 세포 외 sRNAs 질병 바이오 마커의 새로운 클래스를 나타낼 가능성 세포 신호 및 세포 간 통신 네트워크에 참여하고 있습니다. 바이오 마커로서의 가능성을 평가하기 위해, sRNAs 플라즈마, 소변 및 기타 유체에 정량화 할 수있다. 그럼에도 불구하고, 충분히 내분비 신호로서 세포 sRNAs의 영향을 이해하기 위해서는, 캐리어 수송성 및 세포 및 조직은 세포 외 스르나 풀 기여 생물학적 유체 (예, 플라즈마)에 이들을 보호하고, 세포 수있는 조직 된 결정하는 것이 중요 수용성의 세포 외 스르나를 이용. 이러한 목표를 달성하기 위해, 세포 외 캐리어 고순도의 집단을 분리하는 것이 중요스르나의 프로파일 링 및 정량. 우리는 이전에 지질 단백질, 특히 고밀도 지단백질 (HDL)을, 셀 및 HDL-의 miRNAs 사이의 기능적인 마이크로 RNA (miRNA의) 크게 질병에 변경되는 수송 있음을 증명하고있다. 여기서는 상세히 밀도 구배 초 원심 분리 (DGUC)과 고속 단백질 액체 크로마토 그래피 (FPLC)를 탠덤 HDL 분리를 이용하는 새로운 프로토콜 높은 모두 사용 하류 프로파일과의 miRNAs 포함한 모든 sRNAs의 정량 고순도 HDL을 얻었다 -throughput 시퀀싱 및 실시간 PCR 접근법. 이 프로토콜은 HDL에 sRNAs의 조사를 위해 귀중한 자원이 될 것입니다.
서론
세포 외 비 코딩 작은 RNA를 (sRNAs)는 질병 바이오 마커 및 잠재적 인 치료 대상의 새로운 클래스를 나타낼 가능성 세포 간 통신 (1)를 용이하게한다. 스르나의 가장 널리 연구 유형은 대략 길이가 22 국세청하며 더 이상 전구체 형태 및 기본 증명서 2에서 처리되는 마이크로 RNA (miRNA의)입니다. 전사적의 miRNAs는 단백질 - 전기 변환 및 mRNA의 분해 (2)의 유도의 억제를 통해 유전자 발현을 조절하는 것으로 입증되었다. 그럼에도 불구하고,의 miRNAs는 sRNAs 많은 종류의 하나입니다; sRNAs가 부모의 tRNA (tRNA의 유래 sRNAs, TDR), 작은 핵 RNA를 (스르나 유래 sRNAs, sndRNA), 작은 핵소체의 RNA (snoRNA 파생 sRNAs, snRNA), 리보솜 RNA를에서 절단 될 수있는 (sRNAs, RDR을 rRNA의 유래 ) RNA를 Y (yDR) 및 기타 다른 RNA를 1. 이 소설 sRNAs의 몇 가지 예는 miRNA가 유사한 기능을하는 것으로보고되었다; 그러나, 생물학적 쿵푸유전자 조절의 역할 3-6 가능성이 있지만 이러한 sRNAs의 많은 nctions가 결정되어야 남아있다. 가장 흥미로운의 miRNAs 및 기타 sRNAs....
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프로토콜
1. HDL 정제 (~ 5.5 일)
- 밀도 구배 초 원심 분리 (DGUC, ~ 5 일)
- 신선한 정맥 혈액에서 분리 된 혈장 9 mL의 100 배 산화 방지제의 90 μL를 추가합니다.
- 단계 1.1.1 (0.0278 g / mL의 KBr을 플라즈마)에서 플라즈마의 9 용액에 0.251 g을 KBr을 추가하여 1.025 g / mL의 1.006 g / ㎖에서 KBr을 가진 플라즈마 밀도를 조정합니다. 모든 소금은 실온에서 용해 및 튜브를 초 원심 분리기 및 모든 거품이 위로 상승하기 위해 전송 될 때까지 플라즈마를 바위.
- 벤드 끝에서 90 ° 1cm로 18 G 바늘의 끝은, 베벨면이 위쪽을 향. 주사기와 18 게이지 바늘을 사용하여, 조심스럽게 플라즈마 (표 1)을 통해 오버레이 솔루션 # 1의 3 mL를 넣습니다.
참고 : 구부러진 바늘이 모든 VLDL / IDL, LDL을 보장하고, HDL 오버레이와 혼합하지 않고 제거됩니다. - 튜브 및 carefu의 메 니스 커스 위로부터 3mm 공간 -이 떠나는 상단 기포의 대부분을 제거에서야 베드로 SW-40Ti 양동이에 튜브를 배치합니다.
- 균형에 (뚜껑 포함) 각 버킷의 무게를, 정확히 반대 버킷 (버킷 ....
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결과
이 프로토콜은 높은 처리량 시퀀싱 또는 실시간 PCR (도 1)에 의해 고순도 HDL에 sRNAs의 정량화를 허용하도록 서로 연결 설정 방법의 연속이다. 가능성이 프로토콜의 영향을 설명하기 위해, HDL은 탠덤 DGUC 및 FPLC 방법으로 인간 혈장에서 정제 하였다. HDL로 (콜레스테롤 분포) 대응 수집 FPLC 분획을 농축하고, 총 RNA는 HDL (총 단백질) 1 mg 내지 분리 하였다. 스르나 라이브러리는 N = 4 건강한 사람을 대상으로 수집 HDL 생성되었다. 모든 인간의 혈액 / 혈장 샘플을 활성 임상 시험 심사위원회 프로토콜 (# 070416)에 따라 수집, 의학의 밴더빌트 대학이 승인 한 사람을 대상으로는 동의에 등록되었다. 준비 스르나 라이브러리는 고급 유전체학 (VANTAGE) DNA 시퀀싱 센터와 데이터 분석을 수행 하였다에 대한 밴더빌트 기술에 순서가되었다내부 파이프 라인을 사용. 데이터 시각화는 소프트웨어를 그래.......
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토론
이 프로토콜은 고순도의 HDL에 높은 처리량 시퀀싱 또는 실시간 PCR에 의해 miRNA가 다른 sRNAs을 정량화하기 위해 설계되었습니다. 어떠한 접근 방식으로, 특별한 고려가 정화 HDL 및 RNA의 처리의 각 단계에 부여하고 sRNAs 정량화한다. 이 프로토콜은 플라즈마의 ≥ 2 mL로 시작하는 프로젝트를 위해 설계되었습니다. 그러나 고품질의 RNA 분석을 성공적으로 친 화성 크로마토 그래피를 이용하여 인간 또는 마우스 혈장 적은 80 μL로부터 정제 HDL 완료 될 수있다 그러나, 큰 시동 플라즈마 볼륨은 여기에 제시된 방법을 이용하여 더 나은 데이터를 생성한다. 샘플 처리 및 추출 방법은 크게 miRNA의 / 스르나의 품질과 수율을 변경할 수 있습니다. 항응고제의 사용은 플라즈마 컬렉션에 필수적인 반면, 하류 추출 가능성에 영향을 미친다. 예를 들어, 헤파린 용이 RNA 추출 14,15 동안 제거되지 않으며, PCR 16-18 이용 하류 효소를 억제 할 수있다. 또한, 제감수 시.......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health), 국립 심장, 폐 및 혈액 연구소(National Heart, Lung and Blood Institute)에서 K.C.V. HL128996, HL113039 및 HL116263에 수여하는 상을 받았습니다. 이 연구는 또한 미국심장협회(American Heart Association)로부터 K.C.V. CSA2066001, D.L.M POST26630003, R.M.A. POST25710170에 수여하는 상을 수상했습니다.
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재료
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| 3x FPLC Superdex 200 컬럼 증가 인라인 | GE 헬스케어 | 28990944 | 10/300 gl |
| SynergyMx | BioTek Instruments | 7191000 | |
| 테이블탑 원심분리기 | Thermo Scientific | 75004525 | Sorvall ST40R |
| 냉장 원심분리기 | Eppendorf | 22629867 | 5417R (USA Scientific을 통해 구매) |
| 마이크로퓨지 | USA Scientific | 2631-0006 | |
| PippenPrep | 세이지 사이언스 | PIP0001 | |
| 2100 바이오분석기 | Agilent | G2938B | |
| 고감도 DNA Assay | , Agilent | 5067-4626 | |
| Sequencing Library qPCR 정량 분석 키트 | , Illumina | SY-930-1010 | |
| ProFlex Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4484073 | |
| QuantStudio 12k Flex | Applied Biosystems | 4471134 | |
| EpMotion Robot | Eppendorf | 960000111 | 5070 |
| 초투명 원심분리기 튜브 | Beckman Coulter | 344059 | |
| Potassium Bromide | Fisher Chemicals | P205-500 | |
| 15 mL 원뿔형 튜브 | Thermo Scientific | 339650 | |
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참고문헌
- Vickers, K. C., Roteta, L. A., Hucheson-Dilks, H., Han, L., Guo, Y. Mining diverse small RNA species in the deep transcriptome. Trends Biochem Sci. 40, 4-7 (2015).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-297 (2004).
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