Isolering av hög-density lipoprotein för icke-kodande Small RNA Kvantifiering
Summary
This protocol describes the isolation and quantification of high-density lipoprotein small RNAs.
Abstract
Mångfalden av små icke-kodande RNA (sRNA) växer snabbt och deras roller i biologiska processer, inklusive genreglering, växer fram. Mest intressant är sRNAs också funnit utanför celler och är stabilt närvarande i alla biologiska vätskor. Som sådan, extracellulära sRNAs representerar en ny klass av sjukdoms biomarkörer och är troligen involverade i cellsignalering och intercellulära kommunikationsnäten. För att bedöma deras potential som biomarkörer kan sRNAs kvantifieras i plasma, urin och andra vätskor. Ändå till fullo förstå effekterna av extracellulära sRNAs som endokrina signaler, är det viktigt att bestämma vilken bärare transportera och skydda dem i biologiska vätskor (t.ex. plasma), vilka celler och vävnader bidrar till extracellulära Srna pooler och celler och vävnader kapabla för att acceptera och använda extracellulär sRNA. För att uppnå dessa mål, är det viktigt att isolera mycket rena populationer av extracellulära bärareför sRNA profilering och kvantifiering. Vi har tidigare visat att lipoproteiner, i synnerhet hög-density lipoprotein (HDL), transport funktionella mikroRNA (miRNA) mellan celler och HDL-miRNA signifikant förändrade i sjukdom. Här, vi detalj ett nytt protokoll som utnyttjar tandem HDL isolering med densitetsultracentrifugering (DGUC) och snabb-protein-vätskekromatografi (FPLC) för att erhålla högren HDL för nedströms profilering och kvantifiering av alla sRNAs, inklusive miRNA, med användning av både hög -throughput sekvensering och realtids-PCR metoder. Detta protokoll kommer att vara en värdefull resurs för att undersöka sRNAs på HDL.
Introduction
Extracellulära icke-kodande små RNA (sRNAs) representerar en ny klass av sjukdoms biomarkörer och potentiella terapeutiska mål och sannolikt underlätta cell-till-cellkommunikation 1. Den mest studerade typen av sRNA är mikroRNA (miRNA) som är cirka 22 nätter i längd och bearbetas från längre föregångare former och primära transkript 2. miRNA har demonstrerats till post-transkriptionellt reglera genuttrycket genom undertryckande av proteintranslation och induktion av mRNA nedbrytning 2. Ändå miRNA är bara en av många typer av sRNAs; som sRNAs kan klyvas från moder tRNA (tRNA-härledda sRNAs, TDR), små nukleära RNA (sRNA-härledda sRNAs, sndRNA), små nukleolära RNA (snoRNA-härledda sRNAs, snRNA), ribosomala RNA (rRNA-härledda sRNAs, RDR ), Y-RNA (yDR), och andra diverse RNA 1. Några exempel på dessa nya sRNAs har rapporterats att fungera som liknar miRNA; emellertid den biologiska fuk tio n er av många av dessa sRNAs återstår att fastställa, även om roller i genreglering sannolikt 3-6. Mest intressant är miRNA och andra sRNAs är stabilt närvarande i extracellulära vätskor, inklusive saliv, plasma, urin, och galla. Extracellulära sRNAs sannolikt skyddas från RNaser genom deras association med extracellulära vesiklar (EV), lipoproteiner, och / eller extracellulära ribonukleoprotein komplex.
Tidigare rapporterade vi att lipoproteiner, nämligen hög-density lipoprotein (HDL), transport miRNA i plasma 7. I denna studie var HDL isolerades med användning av en sekventiell metod för densitets gradient ultracentrifugering (DGUC), snabb-protein-vätskekromatografi (storleksuteslutningskromatografi gelfiltrering, FPLC) och affinitetskromatografi (anti-apolipoprotein AI (apoA-I) immunutfällning ) 7. Använd båda realtids-PCR-baserade låg densitet arrayer och individuella miRNA analyser var miRNA nivåer kvantifieras på HDL isoleras från läkathy och hyperkolesterolemiska försökspersoner 7. Med hjälp av denna metod, kunde vi profilera miRNA och kvantifiera specifika miRNA i mycket rena HDL preparat. Sedan 2011 har vi fastställt att även affinitetskromatografi ökar HDL renhet, antikroppsmättnad begränsar kraftigt avkastning, och kan vara kostsamt. För närvarande rekommenderar våra protokoll ett två-stegs sekventiell tandem metod för DGUC följt av FPLC, som också producerar högkvalitativa HDL prover för nedströms RNA-isolering och sRNA kvantifiering. På grund av de senaste framstegen inom high-throughput sekvensering av sRNAs (sRNAseq), t.ex. miRNA, och ökad medvetenhet om andra icke-miRNA Srna klasser, är sRNAseq den nuvarande state-of-the-art i miRNA och sRNA profilering. Som sådan, rekommenderar våra protokoll kvantifiera miRNAs och andra sRNAs på HDL prover med sRNAseq. Icke desto mindre kan totalt RNA isolerat från HDL också användas för att kvantifiera individuella miRNA och andra sRNAs eller validera sRNAseq resultat med hjälp av realtids-PCR enpproaches. Här beskriver vi i detalj ett protokoll för insamling, rening, kvantifiering, dataanalys och validering av högrent HDL-sRNAs.
Det övergripande målet med denna uppsats är att demonstrera och processen för sRNA kvantifiering i mycket ren HDL isoleras från human plasma.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll är utformad för att kvantifiera miRNA och andra sRNAs genom hög genomströmning sekvensering eller realtids-PCR på högren HDL. Som med alla synsätt, bör särskilda överväganden ges till varje steg i processen för rening av HDL och RNA och sedan kvantifiera sRNAs. Detta protokoll är avsedd för projekt som börjar med ≥ 2 ml plasma. Ändå kan högkvalitativa RNA analyser framgångsrikt kompletteras med HDL renas från så lite som 80 mikroliter av humant eller mus plasma med hjälp av affini…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by awards from the National Institutes of Health, National Heart, Lung and Blood Institute to K.C.V. HL128996, HL113039, and HL116263. This work was also supported by awards from the American Heart Association to K.C.V. CSA2066001, D.L.M POST26630003, and R.M.A. POST25710170.
Materials
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A99839 | Optima XPN-80 |
| Ultracentrifuge Rotor | Beckman Coulter | 331362 | SW-41Ti |
| AKTA Pure FPLC System | GE Healthcare | 29018224 | |
| 3X FPLC Superdex 200 Increase Columns In-line | GE Healthcare | 28990944 | 10/300 gl |
| SynergyMx | BioTek Instruments | 7191000 | |
| Tabletop centrifuge | Thermo Scientific | 75004525 | Sorvall ST40R |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 22629867 | 5417R (purchased through USA Scientific) |
| Microfuge | USA Scientific | 2631-0006 | |
| PippenPrep | Sage Science | PIP0001 | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2938B | |
| High Sensitivity DNA Assay | Agilent | 5067-4626 | |
| Sequencing Library qPCR Quantification Kit | Illumina | SY-930-1010 | |
| ProFlex Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4484073 | |
| QuantStudio 12k Flex | Applied Biosystems | 4471134 | |
| EpMotion Robot | Eppendorf | 960000111 | 5070 |
| Ultra-clear centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344059 | |
| Potassium Bromide | Fisher Chemicals | P205-500 | |
| 15 mL conical tube | Thermo Scientific | 339650 | |
| Micro-centrifugal filters 0.45µm | Millipore | UFC30HV00 | |
| Micro-centrifugal filters 0.22µm | Millipore | UFC30GV00 | |
| miRNAEasy Total RNA Isolation Kits | Qiagen | 217004 | |
| Total Cholesterol colormetric kit | Cliniqa (Raichem) | R80035 | |
| 10,000 m.w. cut-off centrifugation filter | Amicon | UFC801024 | purchased through Millipore |
| PCR strip tubes | Axygen | PCR-0208-C | purchased through Fisher |
| microRNA RT kit | Life Technologies | 4366597 | For 1000 reactions |
| PCR master mix | Life Technologies | 4440041 | 50 mL bottle |
| Pierce BCA kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Clean and Concentrator Kit | Zymo | D4014 | |
| Dialysis tubing | Spectrum Labs | 132118 | purchased through Fisher |
| bcl2fastq2 | Illumina | n/a | Software |
| Cutadapt | https://github.com/marcelm/cutadapt | n/a | Software |
| NGSPERL | github.com/shengqh/ngsperl | n/a | Software |
| CQSTools | github.com/shengqh/CQS.Tools | n/a | Software |
| Bowtie 1.1.2 | http://bowtie-bio.sourceforge.net | n/a | Software |
| GeneSpringGX13.1.1 | Agilent | n/a | Software |
References
- Vickers, K. C., Roteta, L. A., Hucheson-Dilks, H., Han, L., Guo, Y. Mining diverse small RNA species in the deep transcriptome. Trends Biochem Sci. 40, 4-7 (2015).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-297 (2004).
- Haussecker, D., et al. Human tRNA-derived small RNAs in the global regulation of RNA silencing. RNA. 16, 673-695 (2010).
- Li, Z., et al. Extensive terminal and asymmetric processing of small RNAs from rRNAs, snoRNAs, snRNAs, and tRNAs. Nucleic Acids Res. 40, 6787-6799 (2012).
- Martens-Uzunova, E. S., Olvedy, M., Jenster, G. Beyond microRNA–novel RNAs derived from small non-coding RNA and their implication in cancer. Cancer Lett. 340, 201-211 (2013).
- Maute, R. L., et al. tRNA-derived microRNA modulates proliferation and the DNA damage response and is down-regulated in B cell lymphoma. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 1404-1409 (2013).
- Vickers, K. C., Palmisano, B. T., Shoucri, B. M., Shamburek, R. D., Remaley, A. T. MicroRNAs are transported in plasma and delivered to recipient cells by high-density lipoproteins. Nat Cell Biol. 13, 423-433 (2011).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem. 150, 76-85 (1985).
- Chen, C., Khaleel, S. S., Huang, H., Wu, C. H. Software for pre-processing Illumina next-generation sequencing short read sequences. Source Code Biol Med. 9, 8 (2014).
- Vickers, K. C., Remaley, A. T. Lipid-based carriers of microRNAs and intercellular communication. Curr Opin Lipidol. 23, 91-97 (2012).
- Greening, D. W., Xu, R., Ji, H., Tauro, B. J., Simpson, R. J. A protocol for exosome isolation and characterization: evaluation of ultracentrifugation, density-gradient separation, and immunoaffinity capture methods. Methods Mol Biol. 1295, 179-209 (2015).
- Sung, B. H., Ketova, T., Hoshino, D., Zijlstra, A., Weaver, A. M. Directional cell movement through tissues is controlled by exosome secretion. Nat Commun. 6, 7164 (2015).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25, 402-408 (2001).
- Jung, R., Lubcke, C., Wagener, C., Neumaier, M. Reversal of RT-PCR inhibition observed in heparinized clinical specimens. Biotechniques. 23, (1997).
- Johnson, M. L., Navanukraw, C., Grazul-Bilska, A. T., Reynolds, L. P., Redmer, D. A. Heparinase treatment of RNA before quantitative real-time RT-PCR. Biotechniques. 35, 1140-1142 (2003).
- Garcia, M. E., Blanco, J. L., Caballero, J., Gargallo-Viola, D. Anticoagulants interfere with PCR used to diagnose invasive aspergillosis. J Clin Microbiol. 40, 1567-1568 (2002).
- Yokota, M., Tatsumi, N., Nathalang, O., Yamada, T., Tsuda, I. Effects of heparin on polymerase chain reaction for blood white cells. J Clin Lab Anal. 13, 133-140 (1999).
- Bai, X., et al. Predictive value of quantitative PCR-based viral burden analysis for eight human herpesviruses in pediatric solid organ transplant patients. J Mol Diagn. 2, 191-201 (2000).
- McShine, R. L., Sibinga, S., Brozovic, B. Differences between the effects of EDTA and citrate anticoagulants on platelet count and mean platelet volume. Clin Lab Haematol. 12, 277-285 (1990).
- Fichtlscherer, S., et al. Circulating microRNAs in patients with coronary artery disease. Circ Res. 107, 677-684 (2010).
- Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. MicroRNA profiling: approaches and considerations. Nat Rev Genet. 13, 358-369 (2012).
- Kirschner, M. B., et al. Haemolysis during sample preparation alters microRNA content of plasma. PLoS One. 6, e24145 (2011).
- Kannan, M., Atreya, C. Differential profiling of human red blood cells during storage for 52 selected microRNAs. Transfusion. 50, 1581-1588 (2010).
- Chen, S. Y., Wang, Y., Telen, M. J., Chi, J. T. The genomic analysis of erythrocyte microRNA expression in sickle cell diseases. PLoS One. 3, e2360 (2008).
- Balzano, F., et al. miRNA Stability in Frozen Plasma Samples. Molecules. 20, 19030-19040 (2015).
- Redgrave, T. G., Roberts, D. C., West, C. E. Separation of plasma lipoproteins by density-gradient ultracentrifugation. Anal Biochem. 65, 42-49 (1975).
- Cheung, M. C., Wolf, A. C. Differential effect of ultracentrifugation on apolipoprotein A-I-containing lipoprotein subpopulations. J Lipid Res. 29, 15-25 (1988).
- Kunitake, S. T., Kane, J. P. Factors affecting the integrity of high density lipoproteins in the ultracentrifuge. J Lipid Res. 23, 936-940 (1982).
- Laurent, L. C., et al. Meeting report: discussions and preliminary findings on extracellular RNA measurement methods from laboratories in the NIH Extracellular RNA Communication Consortium. J Extracell Vesicles. 4, 26533 (2015).
