열 충격이 치료와 제브라 피쉬 배아의 배수성 조작

Summary

배수성 조작 수정 된 프로토콜은 초기 배아 세포질 분열에 한 사이클 실속을 유도하는 열 쇼크를 사용한다. 이 프로토콜은 제브라에서 설명되지만, 다른 종에도 적용 할 수있다.

Abstract

배수성의 조작은 diploids에 tetraploids에 diploids, 또는 haploids 유용한 변환, 수 있습니다. 그것은 단일 이형 어머니 동질 접합체의 직접 제작이 가능하기 때문에 제브라 다니오 레 리오의에서는 특별히 동형 gynogenetic diploids 생성 유전자 분석에 유용하다. 이 문서에서는 첫 번째 세포주기, 열 쇼크 2 (HS2) 동안 열 펄스에 따라 배수성 복제에 대한 수정 된 프로토콜을 설명합니다. 중심 소체 복제의 억제를 통해,이 방법은 제 2 셀주기 동안 정확한 세포 분열 스톨 초래한다. 영향을받지 DNA 복제에 결합 정확한 하나의 사이클 부문 스톨은 전체 게놈 중복을 초래한다. 이 방법과 관련된 프로토콜은 하나의 세포주기 분할 지연과 배수성 중복을 일으킬 계란과 정자 수집, 정자의 자외선 치료, 체외 수정 및 열 펄스를 포함한다. 이 프로토콜의 수정 된 버전을 적용 할 수있다다른 동물 종의 배수성 변화를 유도한다.

Introduction

이 프로토콜은 gynogenetic haploids (그림 1) 또는 tetraploids의 생산에서 동형 접합 gynogenetic diploids의 생성에서와 같이 제브라 피쉬 배아의 배수성의 조작을 할 수 있습니다. 이것은 정확히 하나의 세포주기 (도 2A, 2B)에 대응하는 세포질 분열에 지연을 유도함으로써 달성된다. 세포질 분열의 중요한 한주기 지연은 열 충격으로 처리함으로써 달성된다. 같은 원래 Streisinger에 동료에 의해 설명 열 충격 (HS)의 표준 프로토콜은 최초의 세포주기 ⁽¹⁾ 동안 한주기 세포 분열 마구간의 결과로, 기간 13 ~ 15 MPF 동안 온도 펄스를 포함했다. 이 프로토콜의 효율은 최근 열 충격 처리 슬라이딩 시간 윈도우 초기 세포주기 스캔에 의해 개선되었다. 이 검사는 여전히 최초의 세포주기 (22 ~ 24 MPF) 내에서, 열 충격에 대한 나중에 포인트를 확인하는 EMBR의 높은 비율의 결과이 경우 제 2 ^{셀이 사이클에 영향을주는} 하나의 사이클 세포 분열 실속과 YOS. 제 세포주기 동안 실험 조작은 2 셀 사이클 동안 세포 분열을 방해 DNA를 콘텐츠 복제를 일으킬 관찰은 또한 다른 어류 ^{3,4-보고되었다.} 용어 "2"히트 펄스 표준 HS 방법보다 이후 시점에서 발생하고, HS2에 의한 세포주기 지연이 제 2 셀의주기 동안 발생하는 반사 – 우리는 열 충격이 (HS2와 같은 변형 된 프로토콜 참조 ). 이러한 연구는 열 쇼크 후 세포질 분열 구속의 기초는 다음의 세포주기에서 스핀들 형성 및 유도를 밭고랑에 영향 히트 펄스 중에 중심 소체 복제의 억제는 것을 보여 주었다. HS2의 100 %에 가까워 세포주기 정지의 수율 결과, 표준 HS ^2보다 4 배 이상으로 배수성 복제까지의 요금.

태아 치료 재치하 할구 세포 사이클링 동안 열 충격이 많은 악영향을 전시, 그 열 충격을 제안하는 것은 세포 ^분열이 필요한 여러 프로세스에 영향을 미칩니다. 열 쇼크가 세포 사이클 (기간 0-30 MPF)의 개시 이전에인가되는 반면에, 만약 그 중심 소체 복제와 특이 간섭 일관된 효과를 보이며 다른 중요한 세포 ^{과정이 영향을} 미치는 것으로 보이지 않는다 . 이 연구는 할구 분할의 개시 이전에 시간이 특히 중심 소체 억제를 통해 배수성을 조작하는 도구로 열 충격을 사용하는 의무가 발달 기간이 나타납니다 것으로 나타났다. 중심 소체 복제에 열 쇼크를위한 명백한 선택의 근본적인 원인은 알 수 있지만, 이러한 ^오 백혈구 세포와 같은 특정 유형의 열 스트레스 하에서 관찰 중심체 하부 구조의 선택적 분해와 관련 될 수있다.

배아 드의 시간 동기화velopment은 체외 수정 (IVF)에 의해 달성된다. 에 배체가 하나의 사이클 세포질 분열의 실속 HS2에 의한 이배체 배아에서 수정 결과 중 처리되지 않은 정자를 사용. 그 DNA를 불 활성화 가교, 하나의 사이클 세포질 분열 스톨이 gynogenetic ^diploids이 될 HSII 유도에 gynogenetic 반수체 배아 ⁽⁶⁾ 결과를 전달 UV 처리 된 정자의 사용. 때문에 결과 전체 게놈 중복의, 후자 gynogenetic diploids는 게놈에 걸쳐 하나 하나 현장에서 동형 접합이다. 간결함을 위해, 우리는 "haploids"및 "동형 접합 diploids"로 동형 접합 gynogenetic 이배체 배아로 반수체 배아를 gynogenetic을 참조하십시오. 가능한 비옥 한 경우, 동형 접합 diploids 멸균 및 치명적인없는 라인을 시작하는 데 사용할 수 있습니다. HS2에 의한 직접 동형 접합체는 쉽게 피 시험 메모리의 이형 캐리어 인 여성에서 동형 접합 diploids 때문에, 유전자 분석이나 유전 화면에 통합되어야한다높은 고정 (50 %)의 ^{비율을 2} 동형 접합체의 관리 포인트 전시 속도.

다음 프로토콜은 HS2을 수행하고 전체 동형 접합체와 배수성 중복을 유도하는 단계를 설명합니다. 배체 생산을 위해, 정자 솔루션은 치료해야한다. 동형 이배체 제조 정자는 UV 처리에 의해 불 활성화되어야한다. 논의에서 설명 된 바와 같이 또한 가시 안료 마커는 동형 diploids의 식별을 용이하게하기 위해 사용될 수있다. 최상의 결과를위한 IVF 절차가이 기간 내에 발생해야하므로 주로 자신의 빛을주기 ^7, 두 성인과 계란의 시작의 처음 3 시간 동안 Zebrafish의 친구는 활동 일주기 ^(8)에 민감합니다.

Protocol

매디슨과 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) 가이드 라인 (위스콘신 대학 – – 매디슨 보증 번호 A3368-01) 모든 동물 실험은 위스콘신 대학에 따라 실시 하였다. 1. 중단 된 결합을 통해 계란 컬렉션 여성을 선택 참고 : IVF 기반 프로토콜 수동 압력 9 여성의 성숙한 계란의 압출에 의존하고 있습니다. 이전 프로토콜 난자 방출 거동을받은 암컷없이 탱크 또는 쌍 교배 직접 암컷을 사?…

Representative Results

한 셀 사이클 토키네 스톨에도 불구하고, DNA 복제 배아 (도 1)의 DNA 콘텐츠의 중복 결과, 예컨대 배아 정상적으로 발생한다. Streisinger에 열 충격 프로토콜 (표준 HS)는 기간 13~15분 게시물 수정 (MPF) 동안 열 펄스를 포함하고 파생 된 방법은 여기에 설명 된 반면, 35 MPF 1, 2에서 첫 번째 배아 세포 분열 동안 주로 세포질 분열 체포를 유도, 열 쇼크 2 (HS2)가, ?…

Discussion

중요한 단계

체외 수정에 효과적 조건에서 작동하는 것이 중요합니다. 성숙한 계란 (1 단계)의 좋은 공급을 보장하기 위해, 암컷이 짝짓기에 대한 설정은 적어도 5 일 동안 짝짓기 십자가에 설정 한 안하고 임신하는 표시해야합니다. 사육 중단하는 동안, 관찰자는 자연 계란 압출의 첫 등장에 대해 적절하게 15 ~ 30 탱크를 모니터링 할 수 있습니다. 제 달걀 가장 계란은 IVF 절차에…

Materials

Zebrafish mating boxes	Aqua Schwarz	SpawningBox1
NaCl	Sigma	S5886
KCl	Sigma	P5405
Na2HPO4	Sigma	S3264
KH2PO4	Sigma	P9791
CaCl2	Sigma	C7902
MgSO4-7H2O	Sigma	63138
NaHCO3	Sigma	S5761
Tricaine	Western Chemical	Tricaine-D (MS 222)	FDA approved (ANADA 200-226)
Tris base	Sigma	77-86-1	to prepare 1 M Tris pH 9.0
HCl	Sigma	920-1	to prepare 1 M Tris pH 9.0
Fish net (fine mesh) (4-5 in)	PennPlax	(ThatFishThatPlace # 212370)	available in ThatFishThatPlace
Plastic spoon			available in most standard stores
Dissecting scissors	Fine Science Tools	14091-09
Dissecting forceps	Dumont	SS	available from Fine Science Tools
Dissecting stereoscope (with transmitted light source)	Nikon	SMZ645	or equivalent
Reflective light source (LED arms)	Fostec	KL1600 LED	or equivalent
Petri plates 10 cm diameter			any maker
Eppendorf tubes 1.5 ml			any maker
Ice bucket			any maker
Pipetteman P-1000			any maker
Pipette tips 1000 µl			any maker
Narrow spatula	Fisher	14-374
Depression glass plate	Corning Inc	722085 (Fisher cat. No 13-748B)	available from Fisher Scientific
UV lamp	UVP	Model XX-15 (cat No. UVP18006201)	available from Fisher Scientific. Although not observed by us with this model, some UV sources have been observed to experience a decrease of intensity over time (if this is the case, see Modifications and Troubleshooting)
UV glasses			any maker
Paper towels			any maker
Kimwipes	Kimberly-Clark	06-666-11	available from Fisher Scientific
Timer stop watch			any maker
Wash bottle	Thermo Scientific	24020500	available from Fisher Scientific
Tea strainer			available in kitchen stores
beakers, 250 ml (2)	Corning Inc.	1000250	available from Fisher Scientific
water bath (2)			any maker, with accurary to 0.1 C (e.g. Shel Lab H2O Bath Series)
Hanks’ Solution 1	see above	see above	8.0g NaCl, 0.4g KCl in 100ml ddH2O. Store at 4°C.
Hanks’ Solution 2	see above	see above	0.358g Anhydrous Na2HPO4, 0.6g KH2PO4 in 100ml ddH2O. Store at 4°C.
Hanks’ Solution 4	see above	see above	0.72g CaCl2 in 50ml ddH2O. Store at 4°C.
Hanks’ Solution 5	see above	see above	1.23g MgSO4 ∙ 7H2O in 50ml ddH2O. Store at 4°C.
Hank's Premix	see above	see above	add, in the following order: 10.0 ml Solution 1;  1.0 ml Solution 2;  1.0 ml Solution 4;  86.0 ml ddH2O;  1.0 ml Solution 5. Store at 4°C
Hanks’ Solution 6	see above	see above	0.33g NaHCO3 in 10ml ddH2O. Prepare fresh the morning of the IVF procedure.
Hank's Solution (final solution)	see above	see above	Combine 990ul of Hank’s Premix and 10ul of freshly made Solution 6 (NaHCO3 solution)