Sviluppo di un più sensibile e specifica Chromogenic Agar Media per la rilevazione di<em> Parahaemolyticus Vibrio</em> E Altro<em> Vibrio</em> Specie
Summary
Detection and isolation of clinically relevant Vibrio species require selective and differential culture media. This study evaluated the ability of a new chromogenic medium to detect and identify V. parahaemolyticus and other related species. The new medium was found to have better sensitivity and specificity than the conventional medium.
Abstract
Infezioni di origine alimentare negli Stati Uniti causata da specie Vibrio hanno mostrato una tendenza al rialzo. Nel genere Vibrio, V. parahaemolyticus è responsabile per la maggior parte delle infezioni -associated Vibrio. Così, la differenziazione precisa tra Vibrio spp. e rilevazione di V. parahaemolyticus è di fondamentale importanza per garantire la sicurezza del nostro approvvigionamento alimentare. Sebbene le tecniche molecolari sono sempre più comuni, i metodi di coltura-base sono ancora regolarmente fatte e sono considerati metodi standard in determinate circostanze. Pertanto, un nuovo mezzo agar cromogeno è stato testato con l'obiettivo di fornire un metodo migliore per l'isolamento e la differenziazione di clinicamente rilevante spp Vibrio. Il protocollo rispetto al limite di sensibilità, specificità e rilevamento per il rilevamento di V. parahaemolyticus tra il nuovo terreno cromogeno e un mezzo convenzionale. Vari V. ceppi parahaemolyticus (n = 22) ripresentando diversi sierotipi e fonte di origine sono stati utilizzati. Essi sono stati precedentemente individuati dalla Food and Drug Administration (FDA) e Centri per il Controllo e la Prevenzione delle Malattie (CDC), e ulteriormente verificati nel nostro laboratorio da tlh -PCR. In almeno quattro prove separate, questi ceppi sono stati inoculati sui cromogenici agar e tiosolfato-citrato-biliari sali-saccarosio (TCBS) agar, che è il mezzo consigliato per la coltura di questa specie, seguita da incubazione a 35-37 ° C per 24 -96 ore. Tre V. ceppi parahaemolyticus (13,6%) non sono cresciuti in modo ottimale su TCBS, comunque esposti colonie verdi se non ci fosse la crescita. Due ceppi (9,1%) non ha dato i colonie ciano attesi sul agar cromogenico. V. non- ceppi parahaemolyticus (n = 32) sono stati testati per determinare la specificità del agar cromogenico. Tra questi ceppi, 31 non sono cresciuti o esposte altre morfologie di colonia. Il recupero medio di V. parahaemolyticus sul chromogenic agar era ~ 96,4% rispetto al agar soia trittico integrato con il 2% di NaCl. In conclusione, il nuovo agar cromogeno è un mezzo efficace per rilevare V. parahaemolyticus e per differenziarlo da altri vibrioni.
Introduction
In qualità di membro del genere Vibrio, V. parahaemolyticus è una curva, batterio a forma di bastoncello Gram-negativi, non sporigeni. Presenta elevata motilità sia in ambienti liquidi e semisolidi. La maggior parte V. ceppi parahaemolyticus non sono patogeni per l'uomo, ma i sottotipi patogeni hanno causato epidemie e pandemie, quindi questa specie è considerata un importante agente patogeno di origine alimentare in molti paesi 1,2. L'incidenza di infezione da Vibrio negli Stati Uniti ha mostrato una tendenza al rialzo dal 2000 3. Tra Vibrio spp., V. parahaemolyticus è la specie più frequentemente riportati causano malattie negli Stati Uniti 4,5. Altre specie clinicamente rilevanti includono V. alginolyticus, V. vulnificus, V. cholerae, ecc Una piccola percentuale delle malattie è causata da specie multiple simultaneamente.
V. parahaemolyticus è un ghiaccinhabitant di acqua marina e quindi ampiamente distribuita nelle acque marine in tutto il mondo, tra cui gli estuari. La specie è stata scoperta nel 1950 a seguito di un focolaio di intossicazione alimentare in Giappone. Negli Stati Uniti, la specie è stato isolato in acqua di mare, sedimenti, e frutti di mare nella regione di Puget Sound 6,7. Filtratori in habitat marini, come molluschi bivalvi, possono porto V. parahaemolyticus come parte della loro flora naturali 8. Come tale, V. infezioni parahaemolyticus in umano sono spesso legati al consumo di frutti di mare contaminati, in particolare frutti di mare crudi o poco cotti. Un percorso meno comune di entrata si verifica quando ferita aperta è esposto ad acqua di mare, che porta a infezioni della pelle. La maggior parte V. ceppi parahaemolyticus non causano malattie umane, ma alcuni sottotipi ospitano fattori di virulenza, come emolisina termostabile diretta (TDH) sono patogeni. I sintomi più frequenti di origine alimentare V. infezione parahaemolyticus sonodiarrea e dolori addominali, seguito da nausea, vomito e febbre. Mal di testa e brividi sono anche riportati. Il periodo di incubazione medio è di 15 ore, ma può essere fino a 96 ore dopo il consumo di una quantità sufficiente di ceppi patogeni 9. La malattia dura da due a tre giorni. I sintomi gastroenterite causata da V. parahaemolyticus sono largamente auto-limitante e quindi il trattamento speciale non è necessaria. I casi lievi di gastroenterite possono essere efficacemente trattati con reidratazione orale. Più gravi malattie possono essere trattati con antibiotici come la tetraciclina o ciprofloxacina 10. tasso di mortalità è circa il 2% per i casi di gastroenterite, ma può essere alto come il 29% per coloro che sviluppano infezione sangue o setticemia. Qualsiasi persona che consuma frutti di mare o ha ferita aperta esposta all'acqua di mare è a rischio di V. infezione parahaemolyticus. La forma più grave di malattie, la setticemia pericolosa per la vita, è più comune in una sottopopolazione con sottostante co medicalli operativi 11, che includono l'alcolismo, malattie del fegato, diabete, malattie renali, tumori maligni, e le altre condizioni che portano ad una risposta immunitario indebolito. In particolare, questo gruppo di individui è anche ad un elevato rischio di contrarre gravi malattie causate da V. vulnificus, che si trova in habitat naturali simili a V. parahaemolyticus.
V. parahaemolyticus è abitualmente isolato usando tiosolfato-citrato-biliari sali-saccarosio (TCBS) agar come un terreno selettivo e differenziale. Arricchimento in acqua peptonata alcalina può precedere isolamento su TCBS agar. presunte colonie su TCBS sono poi ulteriormente testati in una serie di test biochimici e / o saggi molecolari mirati la presenza di geni specie-specifici. Metodi basati sulla PCR sono spesso usati per confermare l'identità di V. parahaemolyticus amplificando il gene emolisina termolabile, tlh 12.
Indipendentemente dal choice dei metodi di conferma, è importante disporre di un mezzo efficace per isolare e differenziare V. parahaemolyticus da altri vibrioni marini, in primo luogo. TCBS è stato solitamente usata per differenziare le specie all'interno del genere Vibrio secondo le loro capacità di fermentare il saccarosio 12. Reazione di fermentazione positiva è accompagnato da un cambiamento di colore dell'indicatore pH bromotimolo blu. V. colonie parahaemolyticus sono abbastanza distintivo TCBS, esibendo blu al colore verde. Tuttavia, questo mezzo non può facilmente distinguere V. alginolyticus e V. cholerae. Proteus saccarosio-fermentazione possono produrre colonie gialle simili a V. cholerae o V. alginolyticus 13. Su isolamento iniziale TCBS, V. parahaemolyticus può anche essere erroneamente identificato come Aeromonas hydrophila, shigelloides Plesiomonas, e Pseudomonas spp 14. Ceppi con ferm saccarosio in ritardosentazione può essere confusa con altri saccarosio nonfermenting Vibrio 13, che comprendono V. parahaemolyticus. TCBS è risultato essere non sensibili contro Escherichia coli, putrefaciens Pseudomonas, tra gli altri. Diverse altre specie cedono verde di colonie grigie, che sono potenzialmente confondibili con V. parahaemolyticus o V. vulnificus 15. Di conseguenza, è desiderabile sviluppare mezzi di cultura alternativa con una migliore sensibilità e specificità verso individuare e isolare V. parahaemolyticus e di altre specie strettamente correlate.
Diverse alternative dei media sono stati recentemente sviluppati. Inoltre l'inclusione di agenti selettivi, più incorporano substrati cromogeni per differenziare le specie in base alle loro attività enzimatiche differenziali. Ad esempio, indoxyl-β-glucoside e indoxyl-β-galattoside sono stati utilizzati come substrati cromogeni differenziare V. paràcolonie haemolyticus (che appaiono blu-verde) da quelle di V. cholerae (viola) a causa della loro capacità di produrre differenziali β-glucosidasi e β-galattosidasi 16. Diverse formulazioni di cromogenico agar sviluppate da diversi gruppi sono stati valutati e sono stati segnalati per eseguire paragonabile o superiore a quella TCBS 17,18,19. Un vantaggio di utilizzare un terreno cromogeno è che la colorazione del mezzo circostante è minimo facilitando così l'isolamento di colonie particolari. In questo studio abbiamo valutato la capacità di un terreno cromogeno nuova formulazione per rilevare ed isolare V. cholerae, V. parahaemolyticus e V. vulnificus; con un focus particolare sulla sua capacità di differenziare V. parahaemolyticus da altre specie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo studio si concentra sullo sviluppo terreni di coltura e di valutazione. Convenzionalmente, TCBS è selettivo e differenziale mezzo utilizzato per l'isolamento e la rilevazione V. parahaemolyticus, V. cholerae e V. vulnificus 12. Tuttavia, le limitazioni sono stati riportati per questo mezzo, come l'incapacità di differenziare V. cholerae da altre specie Vibrio. Il saccarosio e indicatore di pH sono gli agenti di differenziazione di TCBS. Così, la produzione…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo M. Channey, E. Chau, e K. Tomas per la loro assistenza nel progetto. forniture di progetto sono stati in parte finanziati dalla California Polytechnic State University.
Materials
| Reagent/Equipment | |||
| Agar | Fisher Scientific | DF0140-15-4 | may use other brands |
| Autoclave | Any | ||
| BHI powder | Fisher Scientific | DF0418-17-7 | may use other brands |
| Blender | Any | to blend oyster meat | |
| CampyGen gas generator | Hardy Diagnostics | CN035A | to provide a microaerophilic atmosphere; may use other brands |
| Chocolate agar plates | Hardy Diagnostics | E14 | may use other brands |
| Common PCR reagents (dNTPs, MgCl2, Taq Polymerase) | Any | or use PCR beads (Fisher Sci 46-001-014) | |
| Culture tubes | Fisher Scientific | S50712 | may use other brands |
| Eppendorf tubes | Fisher Scientific | S348903 | may use other brands |
| Gel doc | Any | ||
| HardyChrom Vibrio agar plates | Hardy Diagnostics | G319 | This study evaluates this medium |
| Incubator | Any | ||
| Inoculating loops | Fisher Scientific | 22-363-606 | 10 microliter-size was used in this study |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-212 | may use other brands |
| Oysters | Any | ||
| PBS | Fisher Scientific | R23701 | may use other brands |
| Petri dish | Fisher Scientific | FB0875713 | may use other brands |
| Pipette and tips | Any | Sterilized tips | |
| Primers for tlh | IDT DNA | ||
| Scale | Any | ||
| Spreader | Fisher Scientific | 08-100-11 | Beads may be used instead |
| Stomacher blender | Stomacher | 400 | Samples were homogenized at 200 rpm for 30 sec. Other homogenizer can be used. |
| Sterile filter bags for blenders | Fisher Scientific | 01-812-5 | |
| TCBS powder | Hardy Diagnostics | 265020 | This study evaluates this medium |
| Thermocycler | Any | ||
| TSB powder | Fisher Scientific | DF0370-07-5 | may use other brands |
| UV viewing cabinet | Any | Emit long-wave UV light | |
| Water bath | Any | ||
| Name | Sources | Catalog Number | Comments |
| Bacterial species and strains | |||
| Aeromonas hydrophila | ATCC | ||
| Candida albicans | ATCC | ||
| Campylobacter jejuni | ATCC | ||
| Escherichia coli | ATCC | ||
| Proteus mirabilis | ATCC | ||
| Pseudomonas aeruginosa | ATCC | ||
| Staphylococcus aureus | ATCC | ||
| Salmonella Choleraesuis | ATCC | ||
| Shigella boydii | ATCC | ||
| Shigella flexneri | ATCC | ||
| Shigella sonnei | ATCC | ||
| Vibrio alginolyticus | ATCC | ||
| V. cholerae (serotypes include O139, O1, non O1, El Tor biovars) | FDA, ATCC | ||
| V. damsela | FDA | ||
| V. fisherii | 환경과학 | ||
| V. fluvialis | CDC | ||
| V. furnissii | CDC | ||
| V. hollisae | FDA | ||
| V. metschnikovii | ATCC | ||
| V. mimicus | FDA | ||
| V. parahaemolyticus(serotypes include O3:K6, O1:K56, O4:K8, O5:K15, O8, etc) | ATCC, FDA, CDC, Environment | ||
| V. proteolyticus | FDA | ||
| V. vulnificus | FDA |
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