Een niet-invasieve en Technisch Niet-intensieve methode voor Inductie en fenotypering van experimentele bacteriële longontsteking in Muizen
Summary
Verscheidene werkwijzen zijn beschreven in de literatuur voor het modelleren van bacteriële pneumonie bij muizen. Hierin beschrijven we een niet-invasieve, goedkope, snelle werkwijze voor het induceren via aspiratie pneumonie (bijvoorbeeld inhalatie) van een bacterieel inoculum gepipetteerd in de orofarynx. Downstream methoden voor de beoordeling van de pulmonaire aangeboren immuunrespons zijn ook gedetailleerd.
Abstract
Hoewel de gemeenschap verworven pneumonie blijft een groot probleem voor de volksgezondheid, hebben muismodellen van bacteriële longontsteking recent gefaciliteerd significante preklinische vooruitgang in ons begrip van de onderliggende moleculaire en cellulaire pathogenese. In vivo muismodellen vastleggen van de geïntegreerde fysiologie en veerkracht van de afweer reactie in een manier die niet onthuld door alternatieve, vereenvoudigde ex vivo benaderingen. Verscheidene werkwijzen zijn beschreven in de literatuur voor intrapulmonale inoculatie van bacteriën bij muizen, met inbegrip aërosolvorming, intranasale afgifte, perorale endotracheale canule onder blinde omstandigheden en gevisualiseerd en transcutane endotracheale canule. Alle methoden relatieve voordelen en beperkingen. Hierin beschrijven we in detail een niet-invasieve, technisch niet-intensieve, goedkope en snelle werkwijze voor intratracheale afgifte van bacteriën die aspiratie (bijvoorbeeld inhalatie) gaat door de muisvan besmettelijke inoculum gepipetteerd in de oropharynx terwijl onder narcose. Deze methode kan worden gebruikt voor pulmonaire afgifte van een groot aantal niet bijtend biologische en chemische agentia, en is relatief eenvoudig te leren, zelfs voor laboratoria met een minimale eerdere ervaring met pulmonale procedures. Naast een beschrijving aspiratie pneumonie methode wij ook stap voor stap procedures voor het testen van de volgende in vivo pulmonaire aangeboren immuunrespons van de muis, in het bijzonder werkwijzen voor het kwantificeren van bacteriële verwijdering en de cellulaire immuunreactie van de geïnfecteerde luchtwegen. Deze geïntegreerde en eenvoudige benadering longontsteking evaluatie maakt een snelle en grondige evaluatie van het effect van genetische en omgevingsfactoren manipulaties op pulmonale aangeboren immuniteit.
Introduction
De gemeenschap verworven longontsteking blijft de belangrijkste oorzaak van de dood van een infectie in de VS, met weinig algehele verandering in sterftecijfers in de afgelopen 40 jaar, ondanks verbeteringen in de vaccinatie en antibiotische strategieën 1,2. Ondanks het gebrek aan duidelijk vooruitgang op de volksgezondheid niveau de laatste jaren dramatisch vooruitgang geboekt in ons begrip van de moleculaire en cellulaire pathogenese van longontsteking, met veel van deze vooruitgang mogelijk gemaakt door het gebruik van muizenmodellen van longontsteking. De genetische traceerbaarheid van de muis, hebben de gelijkenis van de muizen en menselijke immuunsysteem, en de enorme hoeveelheid-muizen gerichte immunologische reagentia die in de handel verkrijgbaar zijn geworden samen vergemakkelijkt snelle vooruitgang van het veld.
Muismodellen van bacteriële longontsteking in de literatuur beschreven zijn algemeen wordt aangevoerd uit vier technische routes pathogeen inoculatie: i) aërosolvorming; ii) intranasal levering; iii) perorale levering; en iv) chirurgische intratracheale injectie (dwz tracheotomie) 3. Alle besmettingswegen hebben voor- en nadelen 3. Vooral relatieve blootstelling van de bovenste luchtwegen, mogelijke vermenging van oronasale flora, vereisten voor algemene anesthesie, variabiliteit van de aan de distale long inoculum, lobaire verdeling van de geleverde pathogenen, technische eisen deskundigheid en procedurele morbiditeit variëren sterk tussen deze benaderingen.
Veel gebruikte perorale besmetting technieken omvatten endotracheale (translaryngeal) infusen via ofwel een 'blind' (niet zichtbaar) aanpak, of in direct larynx visualisatie 3-5. Beide werkwijzen, terwijl robuust, vereisen grote scholing en voeren ook het risico van trauma aan de bovenste luchtwegen. In dit rapport beschrijven we een technisch non-intensieve, niet-invasieve, goedkope en snelle methode van perorale besmetting, whierbij bacteriën (Klebsiella pneumoniae in de verstrekte voorbeeld) gepipetteerd in de oropharynx van een verdoofde muis om de longen wordt geleverd via aspiratie (dat wil zeggen, inhalatie). Wij en anderen hebben de aspiratiepneumonie techniek met succes 6-9 gebruikt. Deze veelzijdige en makkelijk te leren long-levering werkwijze kan worden uitgebreid tot het leveren van meer extra niet-bijtende middelen aan de longen, met inbegrip van cytokinen en andere proteïnen, pathogeen geassocieerde moleculen (bijvoorbeeld lipopolysaccharide), cellen (dwz adoptieve overdracht), en toxinen (bijvoorbeeld bleomycine). Naast het bespreken van belangrijke technische overwegingen, we beschrijven ook een geïntegreerde, kwantitatieve benadering voor de beoordeling van de daaropvolgende gastheer reactie op longontsteking, met inbegrip van downstream meting van de bacteriële klaring (dwz, kiemgetal [CFU] kwantificering in de longen en perifere organen) en leukocyten accumulatie in het luchtruim.
Protocol
Representative Results
Discussion
Muismodellen van bacteriële longontsteking, samen met gen-targeting en in vivo biologische en farmacologische interventies, zijn kritische inzichten in de pulmonaire afweer reactie. Grote vooruitgang is geboekt in het bijzonder in ons begrip van de chemokines en adhesie moleculen die de aanwerving van neutrofielen regeren tot de geïnfecteerde luchtruim 10,11. In vivo modellen van longontsteking, in tegenstelling tot de cel-gebaseerde of alternatieve benaderingen, hebben ook belangrijke inz…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported in part by the Intramural Research Program of the National Institutes of Health, National Institute of Environmental Health Sciences (Z01 ES102005).
Materials
| Klebsiella pneumoniae, serotype 2 | ATCC | 43816 | |
| Tryptic soy broth | Becton Dickenson | 211825 | |
| Excel Safelet IV Catheters, 18G x 1 1/4" | Claflin Medical Equipment | MEDC-031122 | |
| Hema 3 Solution 1 | Fisher | 23-122-937 | |
| Hema 3 Solution 2 | Fisher | 23-122-952 | |
| Hema 3 Fixative | Fisher | 23-122-929 | |
| 27½ gauge tuberculin syringes | Fisher | 14-826-87 | |
| Lithium heparin plasma collectors | Fisher | 2675187 | |
| L-shaped disposable spreaders | Lab Scientific | DSC | |
| 1x PBS, pH 7.4 | prepared in-house | n/a | Distilled water (5 L), NaCl (40 g), KCl (1 g), Na2HPO4 (5.75 g), KH2PO4 (1 g) |
| ACK lysis buffer | prepared in-house | n/a | NH4Cl (4.145 g), KHCO3 (0.5 g), EDTA (18.6 mg), bring up to 500 ml with distilled water and pH to 7.4 |
References
- Mizgerd, J. P. Acute lower respiratory tract infection. N Engl J Med. 358 (7), 716-727 (2008).
- Waterer, G. W., Rello, J., Wunderink, R. G. Management of community-acquired pneumonia in adults. Am J Respir Crit Care Med. 183 (2), 157-164 (2011).
- Mizgerd, J. P., Skerrett, S. J. Animal models of human pneumonia. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 294 (3), L387-L398 (2008).
- Revelli, D. A., Boylan, J. A., Gherardini, F. C. A non-invasive intratracheal inoculation method for the study of pulmonary melioidosis. Front Cell Infect Microbiol. 2, 164 (2012).
- Morales-Nebreda, L., et al. Intratracheal administration of influenza virus is superior to intranasal administration as a model of acute lung injury. J Virol Methods. 209, 116-120 (2014).
- Aujla, S. J., et al. IL-22 mediates mucosal host defense against Gram-negative bacterial pneumonia. Nat Med. 14 (3), 275-281 (2008).
- Chen, K., et al. Th17 cells mediate clade-specific, serotype-independent mucosal immunity. Immunity. 35 (6), 997-1009 (2011).
- Draper, D. W., et al. ATP-binding cassette transporter G1 deficiency dysregulates host defense in the lung. Am J Respir Crit Care Med. 182 (3), 404-412 (2010).
- Robinson, K. M., et al. Influenza A exacerbates Staphylococcus aureus pneumonia by attenuating IL-1beta production in mice. J Immunol. 191 (10), 5153-5159 (2013).
- Mizgerd, J. P. Molecular mechanisms of neutrophil recruitment elicited by bacteria in the lungs. Semin Immunol. 14 (2), 123-132 (2002).
- Balamayooran, G., Batra, S., Fessler, M. B., Happel, K. I., Jeyaseelan, S. Mechanisms of neutrophil accumulation in the lungs against bacteria. Am J Respir Cell Mol Biol. 43 (1), 5-16 (2010).
- Quinton, L. J., et al. Hepatocyte-specific mutation of both NF-kappaB RelA and STAT3 abrogates the acute phase response in mice. J Clin Invest. 122 (5), 1758-1763 (2012).
- Gowdy, K. M., et al. Key role for scavenger receptor B-I in the integrative physiology of host defense during bacterial pneumonia. Mucosal Immunol. 8 (3), 559-571 (2015).
- Madenspacher, J. H., et al. p53 Integrates host defense and cell fate during bacterial pneumonia. J Exp Med. 210 (5), 891-904 (2013).
- Brain, J. D., Knudson, D. E., Sorokin, S. P., Davis, M. A. Pulmonary distribution of particles given by intratracheal instillation or by aerosol inhalation. Environ Res. 11 (1), 13-33 (1976).
- Card, J. W., et al. Gender differences in murine airway responsiveness and lipopolysaccharide-induced inflammation. J Immunol. 177 (1), 621-630 (2006).
- Ivanov, I. I., et al. Induction of intestinal Th17 cells by segmented filamentous bacteria. Cell. 139 (3), 485-498 (2009).
- Hooper, L. V., Littman, D. R., Macpherson, A. J. Interactions between the microbiota and the immune system. Science. 336 (6086), 1268-1273 (2012).
