Une méthode non-invasive et technique non-intensif pour Induction et phénotypage of Experimental pneumonie bactérienne chez les souris
Summary
Plusieurs procédés ont été décrits dans la littérature pour la modélisation de la pneumonie bactérienne chez les souris. Nous décrivons ici un peu coûteux, un procédé rapide et non invasif destiné à induire une pneumonie par aspiration ( par exemple, inhalation) , d'un inoculum bactérien pipeté dans l'oropharynx. méthodes en aval pour l'évaluation de la réponse immunitaire innée pulmonaire sont également détaillées.
Abstract
Bien que la pneumonie communautaire reste un problème majeur de santé publique, des modèles murins de la pneumonie bactérienne ont récemment facilité les avancées précliniques importantes dans notre compréhension de la pathogenèse cellulaire et moléculaire sous – jacent. Modèles in vivo de souris capturent la physiologie intégrée et de la résilience de la réponse de défense de l' hôte en d' une manière non révélée par, ex vivo approches simplifiées alternatives. Plusieurs procédés ont été décrits dans la littérature pour l'inoculation des bactéries intra-pulmonaire chez la souris, y compris la pulvérisation en aérosol, l'administration intranasale, par voie buccale endotrachéale canulation dans des conditions «aveugle» et visualisé et transcutanée endotrachéale canulation. Toutes les méthodes ont leurs mérites et les limites relatives. Ici, nous décrivons en détail un procédé non invasif sur le plan technique non intensif, peu coûteuse et rapide pour la délivrance intratracheale de bactéries qui implique l' aspiration ( par exemple, inhalation) , par la sourisd'un inoculum infectieux pipeté dans l'oropharynx sous anesthésie générale. Cette méthode peut être utilisée pour l'administration pulmonaire d'une grande variété d'agents biologiques et chimiques non-caustique, et il est relativement facile à apprendre, même pour les laboratoires ayant une expérience minimale préalable avec les procédures pulmonaires. En plus de décrire la méthode de pneumonie par aspiration, nous fournissons également des procédures étape par étape pour le dosage de l'subséquente in vivo la réponse immunitaire innée pulmonaire de la souris, en particulier, des méthodes pour quantifier la clairance bactérienne et la réponse immunitaire cellulaire des voies respiratoires infectées. Cette approche intégrée et simple d'évaluation de la pneumonie permet une évaluation rapide et robuste de l'effet des manipulations génétiques et environnementaux sur l'immunité innée pulmonaire.
Introduction
Pneumonie communautaire demeure la principale cause de décès par infection aux Etats – Unis, avec peu de changements dans les taux de mortalité au cours des 40 dernières années , en dépit des améliorations en matière de vaccination et des stratégies antibiotiques 1,2. Malgré l'absence de progrès sensibles au niveau de la santé publique, au cours des dernières années, des progrès considérables ont été réalisés dans notre compréhension de la pathogenèse moléculaire et cellulaire de la pneumonie, avec un grand nombre de ces avancées rendues possibles par l'utilisation de modèles de souris de l'infection pulmonaire. La traçabilité génétique de la souris, la similitude du murin et le système immunitaire humain et la vaste gamme de réactifs immunologiques murins ciblés qui sont devenus disponibles dans le commerce ont ainsi facilité des progrès rapides du champ.
Des modèles de souris de la pneumonie bactérienne décrite dans la littérature ont généralement compté sur l'un des quatre itinéraires techniques pour pathogène inoculation: i) aérosolisation; ii) intrlivraison anasal; iii) la livraison par voie orale; et iv) l' injection intra – trachéale chirurgicale (ie, trachéotomie) 3. Toutes les voies d'infection ont des avantages et des inconvénients 3. En particulier l'exposition, relative des voies respiratoires supérieures, le potentiel pour le mélange de la flore oronasaux, les exigences pour l'anesthésie générale, la variabilité de l'inoculum livré au poumon distal, la distribution lobaire des agents pathogènes livrés, les exigences d'expertise technique, et de la morbidité procédurale varient considérablement entre ces approches.
Communément techniques utilisées d'infection pérorales comprennent endotrachéale (translaryngée) canulation soit par un (non visualisées) approche «aveugle», ou sous visualisation directe laryngé 3-5. Les deux méthodes, tandis que robuste, nécessitent une formation et portent aussi le risque de traumatisme des voies respiratoires supérieures. Dans le présent rapport, nous décrivons une méthode techniquement non intensive, non-invasive, peu coûteuse et rapide de l'infection par voie orale, wdit bactéries (Klebsiella pneumoniae dans l'exemple fourni) pipetés dans l'oropharynx d'une souris anesthésiée sont livrés aux poumons par aspiration (inhalation). Nous et d' autres ont utilisé la technique de la pneumonie par aspiration avec succès 6-9. Cette méthode poumon-livraison polyvalent et facile à apprendre peut être étendue à la prestation de nombreux agents non caustiques supplémentaires pour les poumons, y compris les cytokines et d' autres protéines, des molécules d'agents pathogènes associés (par exemple, lipopolysaccharide), les cellules ( par exemple, le transfert adoptif), et les toxines (par exemple, la bléomycine). En plus de discuter des considérations techniques importantes, nous décrivons également une approche intégrée, quantitative pour évaluer la réponse de l' hôte à la suite de la pneumonie, y compris la mesure en aval de la clairance bactérienne (c. -à- unité formant colonie [CFU] quantification dans les poumons et périphériques organes) et leucocytaire l'accumulation dans l'espace aérien.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les modèles murins de la pneumonie bactérienne, en partenariat avec le ciblage de gènes et dans les interventions biologiques et pharmacologiques in vivo, ont fourni des informations critiques dans la réponse de la défense de l' hôte pulmonaire. De grands progrès ont été accomplis en particulier dans notre compréhension des chimiokines et des molécules d'adhésion qui régissent le recrutement des neutrophiles à l'espace aérien infecté 10,11. Modèles in vivo</e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported in part by the Intramural Research Program of the National Institutes of Health, National Institute of Environmental Health Sciences (Z01 ES102005).
Materials
| Klebsiella pneumoniae, serotype 2 | ATCC | 43816 | |
| Tryptic soy broth | Becton Dickenson | 211825 | |
| Excel Safelet IV Catheters, 18G x 1 1/4" | Claflin Medical Equipment | MEDC-031122 | |
| Hema 3 Solution 1 | Fisher | 23-122-937 | |
| Hema 3 Solution 2 | Fisher | 23-122-952 | |
| Hema 3 Fixative | Fisher | 23-122-929 | |
| 27½ gauge tuberculin syringes | Fisher | 14-826-87 | |
| Lithium heparin plasma collectors | Fisher | 2675187 | |
| L-shaped disposable spreaders | Lab Scientific | DSC | |
| 1x PBS, pH 7.4 | prepared in-house | n/a | Distilled water (5 L), NaCl (40 g), KCl (1 g), Na2HPO4 (5.75 g), KH2PO4 (1 g) |
| ACK lysis buffer | prepared in-house | n/a | NH4Cl (4.145 g), KHCO3 (0.5 g), EDTA (18.6 mg), bring up to 500 ml with distilled water and pH to 7.4 |
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