Um método não-invasivo e tecnicamente não-intensivo para indução e fenotipagem of Experimental pneumonia bacteriana em ratos
Summary
Vários métodos foram descritos na literatura para a modelagem de pneumonia bacteriana em murganhos. Aqui, nós descrevemos um método de baixo custo, rápida não-invasiva para induzir pneumonia por aspiração (isto é, por inalação) de um inoculo bacteriano pipetados para a orofaringe. métodos a jusante para avaliação da resposta imune inata pulmonar também são detalhados.
Abstract
Embora a pneumonia adquirida na comunidade continua sendo um grande problema de saúde pública, modelos murinos de pneumonia bacteriana recentemente facilitada avanços pré-clínicos significativos em nossa compreensão da patogênese celular e molecular subjacente. Modelos in vivo rato capturar a fisiologia integrada e resiliência da resposta de defesa do hospedeiro em uma forma não revelada por, simplificado vivo abordagens alternativas ex. Vários métodos foram descritos na literatura para a inoculação de bactérias intrapulmonar em ratinhos, incluindo o tratamento com aerossóis, administração intranasal, endotraqueal canulação perorai sob condições "cegas" e visualizadas, e canulação endotraqueal transcutânea. Todos os métodos têm méritos e limitações relativas. Aqui, nós descrevemos em pormenor um método não-invasivo, tecnicamente não intensiva, de baixo custo, e para a entrega rápida intratraqueal de bactérias que envolve a aspiração (isto é, por inalação) pelo mousede um inoculo infeccioso pipetados para a orofaringe, enquanto sob anestesia geral. Este método pode ser utilizado para a administração pulmonar de uma grande variedade de agentes químicos e biológicos não cáustico, e é relativamente fácil de aprender, mesmo para laboratórios com o mínimo de experiência anterior com procedimentos pulmonares. Além de descrever o método de pneumonia por aspiração, nós também fornecemos procedimentos passo-a-passo para ensaio subsequente in vivo resposta imune inata pulmonar do rato, em particular, métodos de quantificação de apuramento bacteriana e resposta imune celular das vias aéreas infectado. Esta abordagem integrada e simples para avaliação da pneumonia permite a avaliação rápida e robusta do efeito de manipulações genéticas e ambientais sobre a imunidade inata pulmonar.
Introduction
Pneumonia adquirida na comunidade continua a ser a principal causa de morte por infecção em os EUA, com pouca mudança global nas taxas de mortalidade nos últimos 40 anos, apesar de melhorias na vacinação e estratégias de antibióticos 1,2. Apesar da falta de progresso perceptível ao nível da saúde pública, nos últimos anos avanços dramáticos foram feitos em nosso entendimento da patogênese molecular e celular de pneumonia, com muitos desses passos em frente possibilitadas pelo uso de modelos de ratos com infecção pulmonar. A rastreabilidade genética do rato, a semelhança do murino e sistema imunológico humano, e a vasta gama de reagentes imunológicos alvo de murino que se tornaram disponíveis comercialmente, em conjunto, facilitou o progresso rápido do campo.
mouse modelos de pneumonia bacteriana descrita na literatura em geral invocada uma das quatro rotas técnicas de inoculação: i) aerosolization; ii) intrentrega anasal; iii) a entrega por via oral; e iv) a injecção intratraqueal cirúrgica (ou seja, traqueotomia) 3. Todas as vias de infecção têm vantagens e desvantagens 3. Em particular, a exposição, relativa das vias aéreas superiores, o potencial para a mistura da flora oronasal requisitos para anestesia geral, a variabilidade do inoculo entregue ao pulmão distai, distribuição lobar dos agentes patogénicos entregues, os requisitos de peritagem técnica, e morbidade processual variam amplamente entre estes abordagens.
Comumente técnicas de infecção por via oral usados incluem endotraqueal (translaríngea) canulação, quer através de uma abordagem "cega" (não visualizado), ou sob visualização direto da laringe 3-5. Ambos os métodos, ao mesmo tempo robusta, requer treinamento substancial e também carregam risco de trauma na via aérea superior. No presente relatório, nós descrevemos um método tecnicamente não-intensivo, não-invasivo, barato e rápido da infecção por via oral, wdeclara bactérias Klebsiella pneumoniae (no exemplo apresentado) pipetada para a orofaringe de um rato anestesiado são entregues para os pulmões por meio de aspiração (isto é, por inalação). Nós e outros autores utilizaram a técnica de pneumonia aspirativa com êxito 6-9. Este método de pulmão de entrega versátil e facilmente aprendido pode ser estendido para a entrega de muitos agentes não cáustico adicionais para os pulmões, incluindo citoquinas e outras proteínas, moléculas associadas a agentes patogénicos (por exemplo, lipopolissacarídeo), células (isto é, a transferência adoptiva), e toxinas (por exemplo, bleomicina). Além de discutir as considerações técnicas importantes, nós também descrevem uma abordagem integrada, quantitativa para avaliar a resposta do hospedeiro após a pneumonia, incluindo a medição a jusante da depuração bacteriana (ou seja, unidades formadoras de colônia [UFC] quantificação nos órgãos do pulmão e periféricos) e leucócitos acumulação no espaço aéreo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Modelos murinos de pneumonia bacteriana, em parceria com o gene alvo e nas intervenções biológicas e farmacológicas in vivo, têm fornecido insights críticos sobre a resposta de defesa do hospedeiro pulmonar. Grandes avanços foram feitos, em particular, no nosso entendimento das quimiocinas e moléculas de adesão que regulam o recrutamento de neutrófilos para o espaço aéreo infectada 10,11. Modelos in vivo de pneumonia, ao contrário de abordagens baseadas em células ou a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported in part by the Intramural Research Program of the National Institutes of Health, National Institute of Environmental Health Sciences (Z01 ES102005).
Materials
| Klebsiella pneumoniae, serotype 2 | ATCC | 43816 | |
| Tryptic soy broth | Becton Dickenson | 211825 | |
| Excel Safelet IV Catheters, 18G x 1 1/4" | Claflin Medical Equipment | MEDC-031122 | |
| Hema 3 Solution 1 | Fisher | 23-122-937 | |
| Hema 3 Solution 2 | Fisher | 23-122-952 | |
| Hema 3 Fixative | Fisher | 23-122-929 | |
| 27½ gauge tuberculin syringes | Fisher | 14-826-87 | |
| Lithium heparin plasma collectors | Fisher | 2675187 | |
| L-shaped disposable spreaders | Lab Scientific | DSC | |
| 1x PBS, pH 7.4 | prepared in-house | n/a | Distilled water (5 L), NaCl (40 g), KCl (1 g), Na2HPO4 (5.75 g), KH2PO4 (1 g) |
| ACK lysis buffer | prepared in-house | n/a | NH4Cl (4.145 g), KHCO3 (0.5 g), EDTA (18.6 mg), bring up to 500 ml with distilled water and pH to 7.4 |
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