Påvisning av pH-avhengig aktivitet av<em> Escherichia coli</em> Anstand HdeB<em> In Vitro</em> og<em> I Vivo</em

Summary

Denne studien beskriver biofysiske, biokjemiske og molekylære teknikker for å karakterisere anstand aktivitet av Escherichia coli HdeB under sure pH-betingelser. Disse metodene har blitt brukt for andre syre-beskyttende anstand som HdeA og kan bli endret for å jobbe for andre anstand og stress forhold.

Abstract

Bakterier er ofte utsatt for miljømessige endringer, for eksempel endringer i pH, temperatur, Redox status, lyseksponering eller mekanisk kraft. Mange av disse betingelsene forårsaker protein utfolder seg i cellen, og har skadelig virkning på overlevelse av organismen. En gruppe av ikke-relaterte, stress-spesifikke molekylære anstand har vist seg å spille viktige roller i overlevelse av disse stressbetingelser. Mens fullt foldet og anstand-inaktiv før stress, disse proteinene raskt utfolde seg og bli anstand-aktiv under bestemte stress forhold. Når aktivert, disse betinget uordnede anstand bindes til et stort antall forskjellige aggregering utsatt proteiner, hindre deres aggregering og enten direkte eller indirekte lette protein refolding ved retur til ikke-stressbetingelser. Den primære metode for å få en mer detaljert forståelse om mekanismen for deres aktivering og klient erkjennelse innebærer rensing og subsequent karakterisering av disse proteiner ved anvendelse av in vitro-anstand analyser. Oppfølging in vivo spennings analyser er helt avgjørende for å uavhengig bekrefte den erholdte in vitro-resultater.

Denne protokollen beskriver in vitro og in vivo metoder for å karakterisere anstand aktivitet av E. coli HdeB, en syre-aktivert anstand. Lysspredningsmålinger ble anvendt som en enkel utlesning for HdeB evne til å forhindre at syre-indusert aggregasjon av en etablert modell klient protein, MDH, in vitro. Analytiske ultra-sentrifugeringsforsøk ble brukt for å avsløre kompleksdannelse mellom HdeB og sin klient protein LDH, å kaste lys inn i skjebnen til klient proteiner når de kommer tilbake til ikke-stressbetingelser. Enzymatiske aktivitetsanalyser til klient proteinene ble utført for å overvåke effekten av HdeB på pH-indusert klient inaktivering og aktivering. Til slutt ble overlevelses studier brukt til å over påvirkning av HdeB s anstand funksjon in vivo.

Introduction

En vanlig naturlig miljø der mikrobielle patogener oppleve syre-indusert protein utfolder forhold er pattedyr magen (pH 1-4), hvis sur pH fungerer som en effektiv barriere mot matbårne patogener ^1. Protein utfolding og aggregering, som er forårsaket av aminosyresidekjede protonering, virker biologiske prosesser, skader cellulære strukturer og til slutt fører til celledød ^1,2. Siden pH-verdien av den bakterielle periplasmaet likevekt nesten øyeblikkelig med miljø pH på grunn av den frie diffusjon av protoner gjennom det porøse ytre membran, periplasmatiske og indre membranproteiner av gram-negative bakterier er de mest utsatte cellulære komponenter under syre-spenningstilstander ^3. For å beskytte deres periplasmatiske proteom- mot raske syre-mediert skade, Gram-negative bakterier utnytte de syre aktivert periplasmatiske anstand HdeA og HdeB. HdeA er en betinget uordnede anstand <sup> 4,5: ved nøytral pH-verdi, er HdeA til stede som en foldet, anstand-dimer inaktiv. Ved en pH skift under pH 3, er HdeA sin anstand funksjonen raskt aktivert ^6,7. Aktivering av HdeA krever dyptgripende strukturelle endringer, herunder dissosiasjon inn monomerer, og delvis utspiller seg av monomerene ^6-8. Når aktivert, HdeA binder seg til proteiner som utspiller seg under sure forhold. Det forhindrer effektivt deres aggregering både under inkuberingen ved lav pH, så vel som ved pH nøytralisering. Ved retur til pH 7,0, letter HdeA refolding av sine klient proteiner i en ATP uavhengig og konverterer tilbake til sin dimer, anstand-inaktive konformasjon ^9. Tilsvarende er det homologe anstand HdeB også anstand-inaktiv ved pH 7,0. I motsetning HdeA, men når HdeB sin anstand aktivitet sin tilsynelatende maksimum ved pH 4,0, under hvilke forhold HdeB er fortsatt i stor grad brettet og dimere ^10. Videre ytterligere senke pH-Causes inaktivering av HdeB. Disse resultatene foreslår at til tross for sin omfattende homologi, HdeA og HdeB varierer i sin modus for funksjonell aktivering slik at de kan dekke et bredt pH-område med deres beskyttende anstand funksjon. En annen anstand som har blitt implisert i syreresistensen til E. coli er den cytoplasmiske Hsp31, som synes å stabilisere utfoldete klient proteiner inntil nøytrale betingelser er gjenopprettet. Den nøyaktige modusen for Hsp31 handling, men har holdt seg gåte ^12. Gitt at andre ropatogene bakterier som Salmonella mangler hdeAB operon, er det svært sannsynlig at andre ennå uidentifiserte periplasmatiske anstand kan eksistere som er involvert i syre motstand av disse bakteriene ^11.

Protokollene som presenteres her tillater å overvåke pH-avhengig anstand aktivitet av HdeB in vitro og in vivo ¹⁰ og kan brukes til å undersøke andre anstandslik som Hsp31. Alternativt kan den komplekse nettverket av transkripsjonsfaktorer som styrer ekspresjonen av hdeAB potensielt bli undersøkt ved in vivo-spenning assay. For å karakterisere anstand funksjon av proteiner in vivo, kan ulike forsøksoppsett brukes. En rute er å bruke protein utfoldelse spenningstilstander og fenotypisk karakter mutante stammer som enten overuttrykker genet av interesse eller bære en sletting av genet. Proteomic studier kan utføres for å identifisere hvilke proteiner ikke lenger aggregat i henhold til stressbetingelser når den anstand er til stede, eller påvirkning av en anstand på et bestemt enzym kan bestemmes under stressbetingelser ved hjelp av enzymatiske analyser ^14-16. I denne studien valgte vi å overuttrykker HdeB i en rpoH sletting belastning, som mangler den varme sjokk sigma faktor 32. RpoH styrer uttrykket av alle store E. coli anstand og dens sletting er kjent for å øke sensitivity miljømessige stress forhold som forårsaker protein utfolder ^15. In vivo-aktivitet av anstand HdeB ble bestemt ved å måle dens evne til å undertrykke pH-følsomheten til Δ rpoH belastning. Alt i alt har de protokoller som er presentert her tilveiebringe en rask og enkel måte å karakterisere aktiviteten av en syreaktivert anstand in vitro så vel som in in vivo sammenheng.

Protocol

1. Uttrykk og rensing av periplasmatiske HdeB MERK: HdeB ble uttrykt i E. coli-celler som inneholder plasmidet pTrc- hdeB 10, og renset fra periplasmaet ved polymyxin lyse. Forbered en overnatting kultur av E. coli-celler som inneholder plasmidet pTrc- hdeB 10 i 30 ml LB inneholdende 200 ug / ml ampicillin (LB Amp). Inokulere fire 1 L kulturer i LB Amp og dyrke dem ved 37 ° C og 200 opm inntil OD 600 nm på 0,7…

Representative Results

HdeA og HdeB er homolog E. coli-proteiner, som er kjent for å beskytte periplasmatiske proteiner mot syrestressbetingelser 10. Vårt arbeid avdekket at lik HdeA, HdeB fungerer også som en syre aktivert molekylære anstand. Men i motsetning til HdeA, HdeB funksjoner ved en pH som fortsatt er potensielt baktericide, men vesentlig høyere enn den pH-optimum på HdeA 6,9,10,22. For å undersøke pH-optimum på HdeB s anstand aktivitet in vitro, ble i…

Discussion

For å studere mekanismen for aktivering og anstand funksjon av HdeB, store mengder HdeB har til å bli uttrykt og renset. En rekke ekspresjonssystemer vektorsystemer er tilgjengelige for produksjon av høye nivåer av et mål-protein, inkludert pTrc eller pBAD vektorer, som begge ble brukt i denne studien. Initiativtakerne er lett tilgjengelig for E. coli RNA polymerase og dermed tillate sterkt oppregulert uttrykk for HdeB i enhver E. coli-stamme. Dette aspektet er spesielt relevant for in v…

Materials

NEB10-beta E. coli cells	New England Biolabs	C3019I
Ampicillin	Gold Biotechnology	A-301-3
LB Broth mix, Lennox	LAB Express	3003
IPTG	Gold Biotechnology	I2481C50
Sodium chloride	Fisher Scientific	S271-10
Tris	Amresco	0826-5kg
EDTA	Fisher Scientific	BP120-500
Polymyxin B sulfate	ICN Biomedicals Inc.	100565
0.2 UM pore sterile Syringe Filter	Corning	431218
HiTrap Q HP (CV 5 ml)	GE Healthcare Life Sciences	17-1153-01
Mini-Protean TGX, 15%	Bio-Rad	4561046
Malate dehydrogenase (MDH)	Roche	10127914001
Potassium phosphate (Monobasic)	Fisher Scientific	BP362-500
Potassium phosphate (Dibasic)	Fisher Scientific	BP363-1
F-4500 fluorescence spectrophotometer	Hitachi	FL25
Oxaloacetate	Sigma	O4126-5G
NADH	Sigma	N8129-100MG
Sodium phosphate monobasic	Sigma	S9390-2.5KG
Sodium phosphate dibasic	Sigma	S397-500
Lactate dehydrogenase (LDH)	Roche	10127230001
Beckman Proteome Lab XL-I analytical Ultracentrifuge	Beckman Coulter	392764	https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/wsrportal.portal?_nfpb=true&_windowLabel=UCM_RENDERER&_urlType=render&wlpUCM_RENDERER_path=%252Fwsr%252Fresearch-and-discovery%252Fproducts-and-services%252Fcentrifugation%252Fproteomelab-xl-a-xl-i%252Findex.htm#2/10//0/25/1/0/asc/2/392764///0/1//0/%2Fwsrportal%2Fwsr%2Fresearch-and-discovery%2Fproducts-and-services%2Fcentrifugation%2Fproteomelab-xl-a-xl-i%2Findex.htm/
Centerpiece, 12 mm, Epon Charcoal-filled	Beckman Coulter	306493
AN-50 Ti Rotor, Analytical, 8-Place	Beckman Coulter	363782
Wizard Plus Miniprep Kit	Promega	A1470	used for plasmid purification (Protocol 5.1)
L-arabinose	Gold Biotechnology	A-300-500
Glycine	DOT Scientific Inc	DSG36050-1000
Fluorescence Cell cuvette	Hellma Analytics	119004F-10-40
Oligonucleotides	Invitrogen
Phusion High-Fidelity DNA polymerase	New England Biolabs	M0530S
dNTP set	Invitrogen	10297018
Hydrochloric Acid	Fisher Scientific	A144-212
Sodium Hydroxide	Fisher Scientific	BP359-500
Amicon Ultra 15 mL 3K NMWL	Millipore	UFC900324
Centrifuge Avanti J-26XPI	Beckman Coulter	393127
Varian Cary 50 spectrophotometer	Agilent Tech
Spectra/Por 1 Dialysis Membrane MWCO: 6 kDa	Spectrum Laboratories	132650
Amicon Ultra Centrifugal Filter Units 30K	Millipore	UFC803024
SDS	Fisher Scientific	bp166-500
Veriti 96-Well Thermal Cycler	Thermo Fisher	4375786