दुनिया भर में कृषि कीट कीट में भ्रूण Microinjection के माध्यम से न्यूक्लिक एसिड की डिलिवरी,<em> Ceratitis capitata</em
Summary
The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.
Abstract
भूमध्य फल मक्खी (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) अत्यंत उच्च कृषि प्रासंगिकता के साथ एक कीट प्रजातियों है। यह अपनी प्रजनन व्यवहार की वजह से है: महिलाओं के फलों और सब्जियों की बाहरी सतह को नुकसान पहुंचा है, जब वे अंडे और उनके लुगदी पर रची लार्वा फ़ीड लेट गई। जंगली सी capitata आबादी परंपरागत रूप से छिड़काव और / या पर्यावरण के अनुकूल दृष्टिकोण, सबसे सफल बाँझ कीट तकनीक (एसआईटी) से किया जा रहा कीटनाशक के माध्यम से नियंत्रित कर रहे हैं। एसआईटी जन-पालन, विकिरण आधारित नसबंदी और पुरुषों है कि दोस्त के लिए अपनी क्षमता को बनाए रखने, लेकिन उपजाऊ संतान उत्पन्न करने में सक्षम नहीं हैं के क्षेत्र रिलीज पर निर्भर करता है। आगमन और जैव प्रौद्योगिकी के उपकरणों के तेजी से विकास के बाद, एक साथ medfly जीनोम अनुक्रम की उपलब्धता के साथ, बहुत इस प्रजाति के जीव विज्ञान के बारे में हमारी समझ को बढ़ाया गया है। इस जीनोम हेरफेर, जो कैरियर के लिए नई रणनीति के प्रसार इष्टn जनसंख्या नियंत्रण के लिए लागू किया जा सकता है।
इस संदर्भ में, भ्रूण microinjection medfly नियंत्रण के लिए उपकरण बॉक्स के विस्तार में एक दोहरी भूमिका निभाता है। जीन है कि कुंजी जैविक प्रक्रियाओं को विनियमित करने के समारोह के साथ हस्तक्षेप करने की क्षमता है, वास्तव में, आणविक मशीनरी medfly invasiveness अंतर्निहित के बारे में हमारी समझ बढ़ती है। इसके अलावा, रोगाणु लाइन परिवर्तन को प्राप्त करने की क्षमता कई ट्रांसजेनिक उपभेदों कि उपन्यास एसआईटी सेटिंग्स में भविष्य क्षेत्र अनुप्रयोगों के लिए परीक्षण किया जा सकता है के उत्पादन की सुविधा। दरअसल, आनुवंशिक हेरफेर वांछनीय लक्षण है कि, उदाहरण के लिए, क्षेत्र में बाँझ नर प्रदर्शन पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है प्रदान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, या कि प्रारंभिक जीवन में मंच मारक हो सकती है। यहाँ हम medfly भ्रूण में न्यूक्लिक एसिड microinject करने के लिए इन दो मुख्य लक्ष्यों को प्राप्त करने के लिए एक विधि का वर्णन।
Introduction
भूमध्य फल मक्खी (medfly) Ceratitis capitata एक सर्वदेशीय प्रजाति है कि बड़े पैमाने पर नुकसान फलों और फसलों की खेती है। यह Tephritidae परिवार है, जो इस तरह के पीढ़ी Bactrocera और Anastrepha से संबंधित उन के रूप में कई कीट प्रजातियों में शामिल हैं, के अंतर्गत आता है। Medfly इस परिवार के सबसे अधिक अध्ययन प्रजाति है, और यह एक मॉडल न केवल कीट हमलों 1 के अध्ययन के लिए, लेकिन यह भी कीट प्रबंधन रणनीति 2 के अनुकूलन के लिए बन गया है।
Medfly एक multivoltine प्रजाति है कि जंगली के 300 से अधिक प्रजातियों और पौधों की खेती 3,4 पर हमला कर सकते है। नुकसान दोनों वयस्क और लार्वा चरणों के कारण होता है: mated महिलाओं oviposition के लिए फल की सतह पियर्स, सूक्ष्मजीवों उनके व्यावसायिक गुणवत्ता को प्रभावित करने के लिए अनुमति देता है, जबकि फलों के गूदे पर लार्वा फ़ीड। तीन लार्वा चरणों के बाद, लार्वा मेजबान से उभरने और मिट्टी में पोटा बना जाना। Ceratitiscapitata अफ्रीका, मध्य पूर्व, पश्चिमी ऑस्ट्रेलिया, मध्य और दक्षिण अमेरिका, यूरोप, और संयुक्त राज्य अमेरिका के 5 क्षेत्रों सहित लगभग एक दुनिया भर में वितरण, प्रदर्शित करता है।
सबसे आम रणनीतियों medfly infestations कीटनाशकों के इस्तेमाल को शामिल सीमित करने (जैसे, मेलाथियान, spinosad) और पर्यावरण के अनुकूल बाँझ कीट तकनीक (एसआईटी) 6। बाद दृष्टिकोण विकिरण ionizing के लिए जोखिम के बाँझ प्रदान की गई पुरुषों के हजारों की सैकड़ों की जंगली में रिलीज करना शामिल है। जंगली महिलाओं के लिए इस तरह निष्फल पुरुषों के संभोग कोई संतान में यह परिणाम है, जनसंख्या के आकार में कमी के कारण, अंततः उन्मूलन के लिए अग्रणी। हालांकि एसआईटी दुनिया भर में कई अभियानों में प्रभावी साबित कर दी है, उसके प्रमुख कमियां पालन और कीड़ों के लाखों लोगों की स्टरलाइज़ रिलीज होने के लिए की उच्च लागत शामिल हैं। जारी किया गया व्यक्तियों का अंकन जंगली कीड़ों के दौरान क्षेत्र में कब्जा से बाँझ भेद करने के लिए आवश्यक हैगतिविधियों की निगरानी और यह वर्तमान में फ्लोरोसेंट पाउडर का उपयोग कर हासिल की है। इन प्रक्रियाओं महंगी हैं और अवांछनीय दुष्प्रभाव 7 लोगों की है।
आदेश का अनुकूलन और / या इस कीट के नियंत्रण के लिए और अधिक प्रभावी तरीकों को विकसित करने के लिए, medfly जीव विज्ञान और आनुवंशिकी व्यापक रूप से दुनिया भर में कई शोधकर्ताओं ने पता लगाया गया है। Medfly जीनोम अनुक्रम 8,9 की उपलब्धता, जीन कार्यों पर उपन्यास जांच की सुविधा होगी। शाही सेना के हस्तक्षेप इस तरह के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है और यह dsRNA (डबल असहाय आरएनए) या siRNA (छोटे दखल आरएनए) के microinjection के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है। इस तकनीक उदाहरण के लिए इस्तेमाल किया गया है, को दिखाना है कि सी में लिंग निर्धारण आणविक झरना capitata केवल आंशिक रूप से ड्रोसोफिला 10 की है कि सम्मान के साथ संरक्षित है।
प्रोटोकॉल के विकास medfly भ्रूण सी अनुमति microinject करने के लिए capitata पहली गैर होना करने के लिए-Drosophilid मक्खी प्रजातियों आनुवंशिक रूप से संशोधित किया जाना है। अपने अंडे दोनों आकृति विज्ञान और प्रतिरोध के मामले में, ड्रोसोफिला के उन लोगों के लिए समान हैं के रूप में 11 सुखाना करने के लिए, प्रोटोकॉल पूर्व blastoderm भ्रूण पहले डी के लिए विकसित में प्लास्मिड डीएनए वितरित करने के लिए मेलानोगास्टर 12,13 शुरू में सी में उपयोग के लिए अनुकूलित किया गया था capitata। ये पहली प्रयोगों medfly रोगाणु लाइन transposable तत्व Minos 11 के आधार पर परिवर्तन की अनुमति दी। बाद में, मूल प्रणाली 14 संशोधित किया गया था अन्य transposon आधारित दृष्टिकोण का उपयोग कर। इस Lepidoptera Trichoplusia नी 15 से piggyBac का मामला है। प्रोटोकॉल के बाद आगे अनुकूलित किया गया है और यह अन्य प्रजातियों tephritid 16-21 के परिवर्तन और कई अन्य Diptera 22-31 की भी अनुमति दी है। इन सभी प्रणालियों एक ठेठ द्विआधारी वेक्टर / सहायक प्लाज्मिड परिवर्तन प्रणाली के उपयोग पर निर्भर: कृत्रिम, दोषपूर्ण परिवहनवांछित जीन युक्त बेटों प्लास्मिड डीएनए में इकट्ठे हुए और Transposase एंजाइम 32 की आपूर्ति से कीट के जीनोम में एकीकृत कर रहे हैं। ट्रांसजेनिक medfly लाइनों की संख्या, उत्पन्न किया गया है एक सशर्त प्रमुख घातक जीन है कि मारक लाती ले जाने उपभेदों सहित कई सुविधाओं के साथ, पुरुष ही संतान उत्पादन तनाव और इस तरह अतिरिक्त sexing रणनीतियों की आवश्यकता नहीं है, और फ्लोरोसेंट शुक्राणु के साथ तनाव, सटीकता को बढ़ाने सकता है जो एसआईटी की निगरानी चरण 33-37 की। हालांकि ट्रांसजेनिक जीवों के जंगलों में रिलीज मच्छरों केवल 38,39 के खिलाफ पायलट परीक्षण में हुई है, कम से कम एक कंपनी क्षेत्र 40 में उनके उपयोग के लिए ट्रांसजेनिक medfly उपभेदों के एक नंबर का मूल्यांकन है।
भ्रूण microinjection भी इस तरह के प्रतिलेखन उत्प्रेरक की तरह प्रेरक न्युक्लिअसिज़ (TALENS), क्लस्टर नियमित रूप से interspaced कम मुरजबंध संबंधी दोहराता के रूप में नए जीनोम संपादन उपकरण के विकास सीआर के पक्ष में जा सकता है (आईएसपीआर) / CRISPR जुड़े प्रोटीन 9 nuclease (Cas9) और घर वापस आना endonucleases जीन (HEGs) है, जो उपन्यास विकासवादी और विकास अध्ययन सक्षम हो जाएगा, साथ ही उपलब्ध जैव प्रौद्योगिकी उपकरण बॉक्स का विस्तार। जीनोम संपादन दृष्टिकोण पहले ही मच्छरों 41 में जीन-ड्राइव सिस्टम की पीढ़ी के लिए अनुमति दी है, और medfly को उनके स्थानांतरण आसन्न है। यहाँ हम medfly भ्रूण में न्यूक्लिक एसिड होता है जो सब से ऊपर उल्लेख किया अनुप्रयोगों के लिए उपयोगी हो सकता है microinjecting के लिए एक सार्वभौमिक प्रोटोकॉल का वर्णन।
Protocol
Representative Results
Discussion
कीट भ्रूण में न्यूक्लिक एसिड की Microinjection एक सार्वभौमिक तकनीक है कि दोनों जीन समारोह और जैव प्रौद्योगिकी अनुप्रयोगों के विश्लेषण की सुविधा है।
कीट प्रजातियों में से एक बढ़ती हुई संख्या से जीन?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank all the members of the “Insect Genetics and Genomics” Laboratory, in particular to Lorenzo Ghiringhelli who has worked at developing, adapting and maintaining the rearing of the medfly over the past thirty years. Part of the representative results of this paper have been reprinted from N. Biotechnology, 25(1) by Scolari F. et al., Fluorescent sperm marking to improve the fight against the pest insect Ceratitis capitata (Wiedemann; Diptera: Tephritidae), 76-84, 2008, with permission from Elsevier (License number 3796240759880). This work received support from Cariplo-Regione Lombardia “IMPROVE” (FS).
Materials
| 1 x injection Buffer | Buffer | 0.1 mM phosphate buffer pH 7.4, 5mM KCl | ||
| Construct Plasmid | DNA | |||
| Helper Plasmid | DNA | |||
| dsRNA | RNA | Phenol-Chloroform purified | ||
| Standard Larval food | Rearing Food | 1.5 L H2O, 100 ml HCl 1%, 5 g broad-spectrum antimicrobial agent used in pharmaceutical products dissolved in 50 ml of ethanol, 400 g sugar, 175 g demineralized brewer’s yeast, 1 kg soft wheat bran | ||
| Carrot Larval Food | Rearing food | 2.5 g Agar, 4 g Sodium Benzoate, 4.5 ml 37% HCl, 42 g yeast extract, 115 g carrot powder, 2.86 g broad-spectrum antimicrobial agent , water to 1L | ||
| Adult Food | Rearing food | yeast extract and sugar (1:10) | ||
| Microscope slides | Sigma-Aldrich | Z692247 | ||
| Injection needles | Eppendorf | 5242956000 | ||
| Microloaders | Eppendorf | 5242956003 | ||
| Double slided tape | ||||
| Whatman Black circle paper | ||||
| Bleach | Generic reagent | Diluite 1:2 before use | ||
| Paintbrush (000) | Generic tool | |||
| Micromanipulator | Instrument | Narishige | MN-153 | |
| Microinjector | Instrument | Eppendorf | Femtojet | |
| Adult cages | Generic tool | |||
| Halocarbon oil 700 | Reagent | Sigma-Aldrich | H8898 | |
| Ceratitis capitata | Animal | The strain used is ISPRA |
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