Modello in vivo per la prova Effetto dell'ipossia sul tumore metastasi
Summary
This manuscript describes the development of an animal model that allows for the direct testing of the effects of tumor hypoxia on metastasis and the deciphering the mechanisms of its action. Although the experiments described here focus on Ewing sarcoma, a similar approach can be applied to other tumor types.
Abstract
Hypoxia has been implicated in the metastasis of Ewing sarcoma (ES) by clinical observations and in vitro data, yet direct evidence for its pro-metastatic effect is lacking and the exact mechanisms of its action are unclear. Here, we report an animal model that allows for direct testing of the effects of tumor hypoxia on ES dissemination and investigation into the underlying pathways involved. This approach combines two well-established experimental strategies, orthotopic xenografting of ES cells and femoral artery ligation (FAL), which induces hindlimb ischemia. Human ES cells were injected into the gastrocnemius muscles of SCID/beige mice and the primary tumors were allowed to grow to a size of 250 mm3. At this stage either the tumors were excised (control group) or the animals were subjected to FAL to create tumor hypoxia, followed by tumor excision 3 days later. The efficiency of FAL was confirmed by a significant increase in binding of hypoxyprobe-1 in the tumor tissue, severe tumor necrosis and complete inhibition of primary tumor growth. Importantly, despite these direct effects of ischemia, an enhanced dissemination of tumor cells from the hypoxic tumors was observed. This experimental strategy enables comparative analysis of the metastatic properties of primary tumors of the same size, yet significantly different levels of hypoxia. It also provides a new platform to further assess the mechanistic basis for the hypoxia-induced alterations that occur during metastatic tumor progression in vivo. In addition, while this model was established using ES cells, we anticipate that this experimental strategy can be used to test the effect of hypoxia in other sarcomas, as well as tumors orthotopically implanted in sites with a well-defined blood supply route.
Introduction
Sarcoma di Ewing (ES) è un tumore maligno aggressivo che colpisce i bambini e gli adolescenti. 1 I tumori si sviluppano nei tessuti molli e ossa, comunemente nelle arti. Mentre la presenza di metastasi è il più potente fattore prognostico sfavorevole unico dei pazienti ES, i meccanismi alla base del loro sviluppo rimangono poco chiari. 2 tumore ipossia è uno dei pochi fattori implicati nella progressione ES. Nei pazienti ES, la presenza di aree non perfuso nel tessuto tumorale è associata a prognosi infausta. 3 In vitro, ipossia aumenta l'invasività delle cellule ES e attiva l'espressione di geni pro-metastatico. 4-6 Tuttavia, nonostante queste linee di evidenza, nessuna prova diretta per ES indotta da ipossia progressione e diffusione esiste. Inoltre, i meccanismi attraverso i quali l'ipossia esercita tali effetti sono, al momento, sconosciute. Quindi, abbiamo creato un modello in vivo per colmare il divario tra esistente I dati in vitro e clinica osservazioni. Questo sistema modello consente verifica diretta degli effetti dell'ipossia sui tumori che si verificano nel loro ambiente naturale, mediante risonanza magnetica (MRI) per seguire la progressione tumorale e metastasi in vivo in combinazione con analisi ex vivo patologiche e molecolari (Figura 1).
Dal momento che nessun modello transgenico stabilito di ES è attualmente disponibile, gli studi in vivo sulle proprietà metastatiche di questi tumori si basano su iniezioni di cellule umane in topi immunocompromessi. Mentre l'uso di animali immunologicamente deteriorate può sottovalutare l'impatto del sistema immunitario sulla progressione della malattia, la possibilità di utilizzare cellule umane aumenta traducibilità di tali studi. Tra i diversi modelli di xenotrapianto, iniezioni sistemiche in vena della coda sono le più facili da eseguire, ma omettono le fasi iniziali di intravasation delle cellule tumorali e la fuga dal sito primario della crescita. 7-12 D'altra parte, orthoto pic xenotrapianto, che coinvolge le iniezioni di cellule tumorali nelle ossa (femore, costola) o ai muscoli, è più tecnicamente impegnativo, ma anche più biologicamente rilevanti per il cancro umano. 13-16 eutanasia animale Tuttavia, in passato, l'elevata morbilità associata con la rapida crescita di tumori primari è spesso richiesto prima dello sviluppo di metastasi. In questo studio, abbiamo impiegato un modello precostituito di iniezioni di cellule nel muscolo gastrocnemio seguita da escissione del tumore primitivo risultante in combinazione con il monitoraggio longitudinale della progressione metastatica dalla risonanza magnetica. 17,18 Tali iniezioni nel muscolo gastrocnemio in prossimità della tibia consentire la crescita del tumore in due ES ambienti naturali – muscoli e le ossa – e provocano metastasi a distanza in località tipicamente colpite negli esseri umani. 18 In tal modo, questo modello riassume con precisione i processi metastatici che si verificano in pazienti ES durante la progressione della malattia.
tenda "> La localizzazione dei tumori primari nel arti posteriori più bassa facilita anche il controllo preciso del afflusso di sangue al tessuto tumorale. femorale legatura (FAL) è una tecnica consolidata utilizzati nella ricerca angiogenesi per bloccare il flusso di sangue alle regioni distali la gamba e indagare la vascolarizzazione dei tessuti in risposta ad ischemia. 19,20 è importante sottolineare che il calo iniziale del flusso sanguigno è seguito da apertura nave garanzia e riperfusione del tessuto osservato circa 3 giorni dopo FAL. 20 Così, quando eseguito in un arto tumore cuscinetto, questo modello ricrea eventi ipossia / riperfusione che si trovano naturalmente nei tumori in rapida crescita e permette la fuga delle cellule tumorali metastatiche a causa di restauro della perfusione al arti posteriori inferiori tramite vasi collaterali di nuova apertura. 21 è importante sottolineare che questa procedura deve essere eseguita quando la dimensione del tumore è abbastanza piccolo per prevenire ipossia eccessivo in tumori di controllo (tipicamente il tumore-cuscinetto vitello volUme di 150-250 mm 3), assicurando significative differenze nei livelli di ipossia tumorale tra controllo e gruppi FAL-trattati.In aggiunta al monitoraggio longitudinale degli effetti dell'ipossia sulla latenza ES e la frequenza di metastasi, questo modello permette anche per la raccolta dei tessuti e lo sviluppo di nuove linee cellulari di entrambi i tumori primari e le metastasi. Importante, lavoro precedente stabilito che le linee cellulari metastasi-derivati presentano maggiore potenziale metastatico dopo la reintroduzione di animali, indicando che la diffusione del tumore è associata a cambiamenti permanenti nel fenotipo delle cellule tumorali, e convalida così l'uso di queste linee cellulari di decifrare i processi metastatici. 18 Collettivamente, questi modelli possono ora essere utilizzati per le analisi genetiche e molecolari necessarie per l'identificazione di percorsi metastatici indotta da ipossia.
Come ipossia è un fattore pro-metastatico migliorare la malignità di vari tumors, il modello può essere utilizzato come una piattaforma per studiare il ruolo dell'ipossia in altri tipi di tumore che si sviluppano naturalmente in arti, come osteosarcoma e rabdomiosarcoma. 21-23 Inoltre, un approccio simile può essere applicato a tumori maligni crescono in altre sedi anatomiche con un percorso ben definito di sangue. In definitiva, il modello può essere modificato e la sua utilità ulteriormente esteso, a seconda dei singoli esigenze di ricerca.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il nostro modello prevede il confronto delle metastasi nei due gruppi sperimentali – un gruppo di controllo, in cui i tumori possono svilupparsi nel hindlimb seguita da amputazione al raggiungimento di un volume di vitello 250 mm 3, e un gruppo ipossia esposti, in cui il tumore- hindlimb cuscinetto è sottoposto a FAL allo stesso volume, seguita da amputazione 3 giorni più tardi. Anche se in questi esperimenti tumori FAL-trattate vengono amputati con un leggero ritardo, rispetto ai tumori di controllo, le lo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Institutes of Health (NIH) grants: UL1TR000101 (previously UL1RR031975) through the Clinical and Translational Science Awards Program, 1RO1CA123211, 1R03CA178809, R01CA197964 and 1R21CA198698 to JK. MRI was performed in the Georgetown-Lombardi Comprehensive Cancer Center’s Preclinical Imaging Research Laboratory (PIRL) and tissue processing in the Georgetown-Lombardi Comprehensive Cancer Center’s Histopathology & Tissue Shared Resource, both supported by NIH/NCI grant P30-CA051008. The authors thank Dan Chalothorn and James E. Faber, Department of Cell Biology and Physiology, University of North Carolina at Chapel Hill, for their assistance with postmortem x-ray angiography, and providing insight and expertise on collaterogenesis.
Materials
| SK-ES1 Human Ewing sarcoma (ES) cells | ATCC | ||
| TC71 Human ES cells | Kindly provided from Dr. Toretsky | ||
| McCoy's 5A (modified) Medium | Gibco by Life Technologies | 12330-031 | |
| RPMI-1640 | ATCC | 30-2001 | |
| PBS | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442-500mL | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Gibco by Life Technologies | 25200-056 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco by Life Technologies | 15140-122 | |
| Fungizone® Antimycotic | Gibco by Life Technologies | 15290-018 | |
| MycoZap™ Prophylactic | Lonza | VZA-2032 | |
| Collagen Type I Rat tail high concetration | BD Biosciences | 354249 | |
| SCID/beige mice | Harlan or Charles River | 250 (Charles River) or 18602F (Harlan) | |
| 1 mL Insulin syringes with permanently attached 28G½ needle | BD | 329424 | |
| Saline (0.9% Sodium Chloride Injection, USP) | Hospira, INC | NDC 0409-7984-37 | |
| Digital calipers | World Precision Instruments, Inc | 501601 | |
| Surgical Tools | Fine Science Tools | ||
| Rimadyl (Carprofen) Injectable | Zoetis | ||
| Hypoxyprobe-1 (Pimonidazole Hydrochloride solid) | HPI, Inc | HP-100mg | |
| hypoxyprobe-2 (CCI-103F-250mg) | HPI, Inc | CCI-103F-250mg | |
| Povidone-iodine Swabstick | PDI | S41350 | |
| Sterile alcohol prep pad | Fisher HealthCare | 22-363-750 | |
| LubriFresh P.M. (eye lubricant ointment) | Major Pharaceuticals | NDC 0904-5168-38 | |
| VWR Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier | VWR | 56617-014 | |
| Oster Golden A5 Single Speed Vet Clipper with size 50 blade | Oster | 078005-050-002 (clipper), 078919-006-005 (blade) | |
| Nair Lotion with baby oil | Church & Dwight Co., Inc. | ||
| Silk 6-0 | Surgical Specialties Corp | 752B | |
| Prolene (polypropylene) suture 6-0 | Ethicon | 8680G | |
| Vicryl (Polyglactin 910) suture 4-0 | Ethicon | J386H | |
| Fisherbrand Applicators (Purified cotton) | Fisher Scientific | 23-400-115 | |
| GelFoam Absorbable Dental Sponges – Size 4 | Pfizer Pharmaceutical | 9039605 | |
| Autoclip Wound Clip Applier | BD | 427630 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Autoclip remover | BD | 427637 | |
| Aound clip | BD | 427631 | |
| MRI 7 Tesla | Bruker Corporation | ||
| Paravision 5.0 software | Bruker Corporation | ||
| CO2 Euthanasia system | VetEquip | ||
| 25G 5/8 Needle (for heart-puncture) | BD | 305122 | |
| 0.1 mL syringe (for heart-puncture) | Terumo | SS-01T | |
| K3 EDTA Micro tube 1.3ml | Sarstedt | 41.1395.105 | |
| 10% Neutral Buttered Formalin | Fisher Scientific | SF100-4 |
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