腫瘍転移に対する低酸素のテストの効果のためのインビボモデル
Summary
This manuscript describes the development of an animal model that allows for the direct testing of the effects of tumor hypoxia on metastasis and the deciphering the mechanisms of its action. Although the experiments described here focus on Ewing sarcoma, a similar approach can be applied to other tumor types.
Abstract
Hypoxia has been implicated in the metastasis of Ewing sarcoma (ES) by clinical observations and in vitro data, yet direct evidence for its pro-metastatic effect is lacking and the exact mechanisms of its action are unclear. Here, we report an animal model that allows for direct testing of the effects of tumor hypoxia on ES dissemination and investigation into the underlying pathways involved. This approach combines two well-established experimental strategies, orthotopic xenografting of ES cells and femoral artery ligation (FAL), which induces hindlimb ischemia. Human ES cells were injected into the gastrocnemius muscles of SCID/beige mice and the primary tumors were allowed to grow to a size of 250 mm3. At this stage either the tumors were excised (control group) or the animals were subjected to FAL to create tumor hypoxia, followed by tumor excision 3 days later. The efficiency of FAL was confirmed by a significant increase in binding of hypoxyprobe-1 in the tumor tissue, severe tumor necrosis and complete inhibition of primary tumor growth. Importantly, despite these direct effects of ischemia, an enhanced dissemination of tumor cells from the hypoxic tumors was observed. This experimental strategy enables comparative analysis of the metastatic properties of primary tumors of the same size, yet significantly different levels of hypoxia. It also provides a new platform to further assess the mechanistic basis for the hypoxia-induced alterations that occur during metastatic tumor progression in vivo. In addition, while this model was established using ES cells, we anticipate that this experimental strategy can be used to test the effect of hypoxia in other sarcomas, as well as tumors orthotopically implanted in sites with a well-defined blood supply route.
Introduction
ユーイング肉腫（ES）は、小児および青年に影響を与える積極的な悪性腫瘍です。 1腫瘍は一般的に手足に、軟部組織および骨に開発しています。転移の存在が、ES患者のための単一の最も強力な予後不良因子であるが、その開発の基礎となるメカニズムは不明です。 2腫瘍の低酸素状態は、ESの進行に関与するいくつかの要因の一つです。 ES患者において、腫瘍組織内の非灌流領域の存在は、予後不良と関連しています。 図3は、 インビトロにおいて 、低酸素症は、ES細胞の侵襲性を増加させ、プロ転移性遺伝子の発現を誘発します。しかし、証拠のこれらの行にもかかわらず、低酸素誘導ESの進行および普及のためには直接の証拠が存在しない4-6。また、低酸素症は、このような効果を発揮する機構は、現時点では不明です。したがって、我々は、in vitroデータおよび臨床obser に既存の間のギャップを埋めるためにin vivoモデルを作成しましたvations。このモデル系は、ex vivoでの病理学的および分子分析（ 図1）と組み合わせて、 インビボでの腫瘍の進行と転移に追従するように、磁気共鳴イメージング（MRI）を使用して、それらの自然環境で発生する腫瘍の低酸素の影響の直接的検査を可能にします。
ESの確立さトランスジェニックモデルは、現在利用可能ではないので、これらの腫瘍の転移特性に関するin vivo試験は、免疫不全マウスにヒト細胞の注射に依存しています。免疫学的障害の動物の使用は、疾患の進行の免疫系の影響を過小評価することができるが、ヒト細胞を使用する能力は、このような研究の翻訳可能を増加させます。異なる異種移植モデルの中では、尾静脈への全身注射は、実行するのが最も簡単です、まだ彼らは、腫瘍細胞の血管内の最初のステップを省略し、成長のプライマリサイトから脱出します。一方7-12、orthoto骨への腫瘍細胞の注射を伴うPICの異種移植、（大腿骨、肋骨）または筋肉は、より技術的に困難なだけでなく、より生物学的に関連するヒト癌のです。 13-16しかし、過去には、原発腫瘍の急速な成長に関連した高い罹患率は、多くの場合、転移の開発の前に殺処分を必要としています。本研究では、MRIによって転移進行の長手方向の監視と合わせ、得られた原発腫瘍の切除に続いて腓腹筋への細胞注射の以前に確立されたモデルを採用しました。筋肉や骨- -脛骨に近接した腓腹筋に17,18このような注射は、2つの固有のES環境において腫瘍増殖を可能にし、一般的にヒトでの影響を受けた場所に遠隔転移が生じます。 18これにより、このモデルが正確に疾患の進行中に、ES患者に発生する転移プロセスを再現します。
テント ">下側後肢における原発腫瘍の局在化は、腫瘍組織への血液供給の正確な制御を容易にする。大腿動脈結紮（FAL）が遠位領域への血流を遮断するために、血管新生の研究に利用されるよく確立された技術であります脚部と虚血に応答して、組織の血管新生を調査する。19,20重要なのは、血流の初期低下が担保血管の開口部と、ほぼ3日FAL後に観察される組織の再灌流が続いている。20このように、腫瘍を有する肢で実行、このモデルは、急速に成長する腫瘍で自然に発生する低酸素/再灌流イベントを再作成し、新しくオープンした側副血管を経由して下位後肢への灌流の回復による転移性腫瘍細胞の脱出を可能にします。21腫瘍サイズがある場合に重要なのは、この手順を実行する必要があります（典型的には、腫瘍を有するウシ容量で対照腫瘍における過剰な低酸素症を防止するのに十分に小さいですコントロールとFAL処置群間の腫瘍低酸素のレベルの有意な差を確保し250 mm 3で）、 – 150の梅。ES待ち時間および転移の頻度の低酸素の影響の長手方向の監視に加えて、このモデルは、組織の収集および原発腫瘍および転移の両方から新たな細胞系の開発を可能にします。重要なことには、以前の研究は、転移由来の細胞株は、腫瘍の播種は、腫瘍細胞の表現型の永久的な変化に関連し、それによって転移プロセスを解読するために、これらの細胞株の使用を検証していることを示す、動物に再導入時に強化転移の可能性を示すことを確立しました。 図18は、集合的に、これらのモデルは、現在、低酸素誘導性の転移の経路を識別するために必要な遺伝的および分子分析のために使用することができます。
低酸素症のような様々なトンの悪性度を高めるプロ転移因子でありますumors、我々のモデルは、例えば、骨肉腫および横紋筋肉腫のような自然に手足に発症する他の腫瘍タイプにおける低酸素の役割を調査するためのプラットフォームとして使用することができます。 21-23はまた、同様のアプローチは、血液供給の明確に定義された経路と他の解剖学的部位で増殖する悪性腫瘍に適用することができます。最終的に、モデルを変更することができ、その有用性はさらに、個々の研究の必要性に応じて、延長しました。
Protocol
Representative Results
Discussion
腫瘍が250ミリメートル3のふくらはぎのボリュームに達したときに切断が続く後肢に開発することが許可されている対照群、および低酸素曝露群で腫瘍-我々のモデルは、2つの実験群における転移の比較を含みます軸受後肢は3日後に切断、続いて、同じ音量でFALに供されます。対照腫瘍と比較して、これらの実験でFAL処理された腫瘍は、少し遅れて切断されているにもかかわらず、そ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Institutes of Health (NIH) grants: UL1TR000101 (previously UL1RR031975) through the Clinical and Translational Science Awards Program, 1RO1CA123211, 1R03CA178809, R01CA197964 and 1R21CA198698 to JK. MRI was performed in the Georgetown-Lombardi Comprehensive Cancer Center’s Preclinical Imaging Research Laboratory (PIRL) and tissue processing in the Georgetown-Lombardi Comprehensive Cancer Center’s Histopathology & Tissue Shared Resource, both supported by NIH/NCI grant P30-CA051008. The authors thank Dan Chalothorn and James E. Faber, Department of Cell Biology and Physiology, University of North Carolina at Chapel Hill, for their assistance with postmortem x-ray angiography, and providing insight and expertise on collaterogenesis.
Materials
| SK-ES1 Human Ewing sarcoma (ES) cells | ATCC | ||
| TC71 Human ES cells | Kindly provided from Dr. Toretsky | ||
| McCoy's 5A (modified) Medium | Gibco by Life Technologies | 12330-031 | |
| RPMI-1640 | ATCC | 30-2001 | |
| PBS | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442-500mL | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Gibco by Life Technologies | 25200-056 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco by Life Technologies | 15140-122 | |
| Fungizone® Antimycotic | Gibco by Life Technologies | 15290-018 | |
| MycoZap™ Prophylactic | Lonza | VZA-2032 | |
| Collagen Type I Rat tail high concetration | BD Biosciences | 354249 | |
| SCID/beige mice | Harlan or Charles River | 250 (Charles River) or 18602F (Harlan) | |
| 1 mL Insulin syringes with permanently attached 28G½ needle | BD | 329424 | |
| Saline (0.9% Sodium Chloride Injection, USP) | Hospira, INC | NDC 0409-7984-37 | |
| Digital calipers | World Precision Instruments, Inc | 501601 | |
| Surgical Tools | Fine Science Tools | ||
| Rimadyl (Carprofen) Injectable | Zoetis | ||
| Hypoxyprobe-1 (Pimonidazole Hydrochloride solid) | HPI, Inc | HP-100mg | |
| hypoxyprobe-2 (CCI-103F-250mg) | HPI, Inc | CCI-103F-250mg | |
| Povidone-iodine Swabstick | PDI | S41350 | |
| Sterile alcohol prep pad | Fisher HealthCare | 22-363-750 | |
| LubriFresh P.M. (eye lubricant ointment) | Major Pharaceuticals | NDC 0904-5168-38 | |
| VWR Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier | VWR | 56617-014 | |
| Oster Golden A5 Single Speed Vet Clipper with size 50 blade | Oster | 078005-050-002 (clipper), 078919-006-005 (blade) | |
| Nair Lotion with baby oil | Church & Dwight Co., Inc. | ||
| Silk 6-0 | Surgical Specialties Corp | 752B | |
| Prolene (polypropylene) suture 6-0 | Ethicon | 8680G | |
| Vicryl (Polyglactin 910) suture 4-0 | Ethicon | J386H | |
| Fisherbrand Applicators (Purified cotton) | Fisher Scientific | 23-400-115 | |
| GelFoam Absorbable Dental Sponges – Size 4 | Pfizer Pharmaceutical | 9039605 | |
| Autoclip Wound Clip Applier | BD | 427630 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Autoclip remover | BD | 427637 | |
| Aound clip | BD | 427631 | |
| MRI 7 Tesla | Bruker Corporation | ||
| Paravision 5.0 software | Bruker Corporation | ||
| CO2 Euthanasia system | VetEquip | ||
| 25G 5/8 Needle (for heart-puncture) | BD | 305122 | |
| 0.1 mL syringe (for heart-puncture) | Terumo | SS-01T | |
| K3 EDTA Micro tube 1.3ml | Sarstedt | 41.1395.105 | |
| 10% Neutral Buttered Formalin | Fisher Scientific | SF100-4 |
References
- Lessnick, S. L., Ladanyi, M. Molecular pathogenesis of Ewing sarcoma: new therapeutic and transcriptional targets. Annu Rev Pathol. 7, 145-159 (2012).
- Ladenstein, R. Primary disseminated multifocal Ewing sarcoma: results of the Euro-EWING 99 trial. J Clin Oncol. 28, 3284-3291 (2010).
- Dunst, J., Ahrens, S., Paulussen, M., Burdach, S., Jurgens, H. Prognostic impact of tumor perfusion in MR-imaging studies in Ewing tumors. Strahlenther Onkol. 177, 153-159 (2001).
- Aryee, D. N. Hypoxia modulates EWS-FLI1 transcriptional signature and enhances the malignant properties of Ewing’s sarcoma cells in vitro. 암 연구학. 70, 4015-4023 (2010).
- Knowles, H. J., Schaefer, K. L., Dirksen, U., Athanasou, N. A. Hypoxia and hypoglycaemia in Ewing’s sarcoma and osteosarcoma: regulation and phenotypic effects of Hypoxia-Inducible Factor. BMC cancer. 10, 372 (2010).
- Tilan, J. U. Hypoxia shifts activity of neuropeptide Y in Ewing sarcoma from growth-inhibitory to growth-promoting effects. Oncotarget. 4, 2487-2501 (2013).
- Franzius, C. Successful high-resolution animal positron emission tomography of human Ewing tumours and their metastases in a murine xenograft model. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 33, 1432-1441 (2006).
- Hauer, K. DKK2 mediates osteolysis, invasiveness, and metastatic spread in Ewing sarcoma. 암 연구학. 73, 967-977 (2012).
- Manara, M. C. Preclinical in vivo study of new insulin-like growth factor-I receptor–specific inhibitor in Ewing’s sarcoma. Clin Cancer Res. 13, 1322-1330 (2007).
- Scotlandi, K. Murine model for skeletal metastases of Ewing’s sarcoma. J Orthop Res. 18, 959-966 (2000).
- Vormoor, J. Establishment of an in vivo model for pediatric Ewing tumors by transplantation into NOD/scid mice. Pediatr Res. 49, 332-341 (2001).
- Picarda, G. Preclinical evidence that use of TRAIL in Ewing’s sarcoma and osteosarcoma therapy inhibits tumor growth, prevents osteolysis, and increases animal survival. Clin Cancer Res. 16, 2363-2374 (2010).
- Vormoor, B. Development of a preclinical orthotopic xenograft model of ewing sarcoma and other human malignant bone disease using advanced in vivo imaging. PLoS One. 9, e85128 (2014).
- Wang, Y. Platelet-derived growth factor receptor beta inhibition increases tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) sensitivity: imatinib and TRAIL dual therapy. Cancer. 116, 3892-3902 (2010).
- Wang, Y. X. Inhibiting platelet-derived growth factor beta reduces Ewing’s sarcoma growth and metastasis in a novel orthotopic human xenograft model. In Vivo. 23, 903-909 (2009).
- Odri, G. A. Zoledronic acid as a new adjuvant therapeutic strategy for Ewing’s sarcoma patients. 암 연구학. 70, 7610-7619 (2010).
- Merchant, M. S. Interferon gamma enhances the effectiveness of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor agonists in a xenograft model of Ewing’s sarcoma. 암 연구학. 64, 8349-8356 (2004).
- Hong, S. H. High neuropeptide Y release associates with Ewing sarcoma bone dissemination – in vivo model of site-specific metastases. Oncotarget. 6, 7151-7165 (2015).
- Lee, E. W. Neuropeptide Y induces ischemic angiogenesis and restores function of ischemic skeletal muscles. J Clin Invest. 111, 1853-1862 (2003).
- Tilan, J. U. Platelet neuropeptide Y is critical for ischemic revascularization in mice. FASEB J. , (2013).
- Toffoli, S., Michiels, C. Intermittent hypoxia is a key regulator of cancer cell and endothelial cell interplay in tumours. The FEBS journal. 275, 2991-3002 (2008).
- Das, B. Hypoxia enhances tumor stemness by increasing the invasive and tumorigenic side population fraction. Stem cells (Dayton, Ohio). 26, 1818-1830 (2008).
- Arndt, C. A., Rose, P. S., Folpe, A. L., Laack, N. N. Common musculoskeletal tumors of childhood and adolescence. Mayo Clin Proc. 87, 475-487 (2012).
- Mendoza, A. A novel noninvasive method for evaluating experimental lung metastasis in mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 52, 584-589 (2013).
- Feldman, D. B., Seely, J. C. . Necropsy Guide: Rodents and the Rabbit. , (1988).
- Parkinson, C. M. Diagnostic necropsy and selected tissue and sample collection in rats and mice. J Vis Exp. , (2011).
- Raymond, A. K., Lazar, A. J., PP, L. i. n., S, P. a. t. e. l. . Bone Sarcoma. , (2013).
- Dietel, M., Arps, H., Gerding, D., Trapp, M., Niendorf, A. Establishment of primary cell cultures: experiences with 155 cell strains. Klin Wochenschr. 65, 507-512 (1987).
- Varghese, A. J., Gulyas, S., Mohindra, J. K. Hypoxia-dependent reduction of 1-(2-nitro-1-imidazolyl)-3-methoxy-2-propanol by Chinese hamster ovary cells and KHT tumor cells in vitro and in vivo. 암 연구학. 36, 3761-3765 (1976).
