In vivo modell för att testa effekten av hypoxi på tumörmetastas
Summary
This manuscript describes the development of an animal model that allows for the direct testing of the effects of tumor hypoxia on metastasis and the deciphering the mechanisms of its action. Although the experiments described here focus on Ewing sarcoma, a similar approach can be applied to other tumor types.
Abstract
Hypoxia has been implicated in the metastasis of Ewing sarcoma (ES) by clinical observations and in vitro data, yet direct evidence for its pro-metastatic effect is lacking and the exact mechanisms of its action are unclear. Here, we report an animal model that allows for direct testing of the effects of tumor hypoxia on ES dissemination and investigation into the underlying pathways involved. This approach combines two well-established experimental strategies, orthotopic xenografting of ES cells and femoral artery ligation (FAL), which induces hindlimb ischemia. Human ES cells were injected into the gastrocnemius muscles of SCID/beige mice and the primary tumors were allowed to grow to a size of 250 mm3. At this stage either the tumors were excised (control group) or the animals were subjected to FAL to create tumor hypoxia, followed by tumor excision 3 days later. The efficiency of FAL was confirmed by a significant increase in binding of hypoxyprobe-1 in the tumor tissue, severe tumor necrosis and complete inhibition of primary tumor growth. Importantly, despite these direct effects of ischemia, an enhanced dissemination of tumor cells from the hypoxic tumors was observed. This experimental strategy enables comparative analysis of the metastatic properties of primary tumors of the same size, yet significantly different levels of hypoxia. It also provides a new platform to further assess the mechanistic basis for the hypoxia-induced alterations that occur during metastatic tumor progression in vivo. In addition, while this model was established using ES cells, we anticipate that this experimental strategy can be used to test the effect of hypoxia in other sarcomas, as well as tumors orthotopically implanted in sites with a well-defined blood supply route.
Introduction
Ewing sarkom (ES) är en aggressiv malignitet drabbar barn och ungdomar. 1 Tumörerna utvecklas i mjukdelar och ben, vanligen i armar och ben. Medan närvaron av metastaser är den enskilt mest kraftfulla negativa prognostisk faktor för ES patienter, de mekanismer som ligger bakom deras utveckling fortfarande oklara. 2 Tumör hypoxi är en av de få faktorer som är inblandade i ES progression. I ES patienter är förekomsten av icke-perfusion områden inom tumörvävnaden i samband med dålig prognos. 3 In vitro ökar hypoxi invasions av ES-celler och utlöser expression av pro-metastaserande gener. 4-6 Trots dessa rader av bevis, finns det ingen direkt bevis för hypoxi-inducerad ES progression och spridning. Dessutom de mekanismer genom vilka hypoxi utövar sådana effekter är för närvarande okänd. Därför har vi skapat en in vivo-modell för att fylla gapet mellan befintliga in vitro-data och klinisk observationer. Detta modellsystem möjliggör direkt kontroll av effekterna av hypoxi på tumörer som förekommer i deras naturliga miljö, med hjälp av magnetisk resonanstomografi (MRT) för att följa tumörprogression och metastas in vivo i kombination med ex vivo patologiska och molekylära analyser (Figur 1).
Eftersom ingen etablerad transgen modell av ES är för närvarande tillgängliga, studier på metastaserande egenskaperna hos dessa tumörer in vivo beroende av injektioner av humana celler i nedsatt immunförsvar möss. Även om användningen av immunologiskt nedsatt djur kan underskatta effekterna av immunsystemet på sjukdomsförloppet, ökar möjligheten att använda mänskliga celler översättbarhet av sådana studier. Bland olika xenograft-modeller, systemiska injektioner i svansvenen är lättast att utföra, men de utelämnar de första stegen av tumörcell intravasering och fly från den primära platsen för tillväxt. 7-12 Å andra sidan, orthoto pic xenografting, vilket innebär injektioner av tumörceller i ben (lårbenet, revben) och muskler, är mer tekniskt utmanande, men också mer biologiskt relevanta för människors cancer. 13-16 Men i det förflutna, hög sjuklighet i samband med en snabb tillväxt av primära tumörer har ofta nödvändig avlivning innan metastaser utveckling. I denna studie använde vi en tidigare etablerad modell av cellinjektioner i gastrocnemiusmuskeln följt av excision av den resulterande primära tumören i kombination med längsgående övervakning av metastasutvecklingen med MRI. 17,18 Sådana injektioner i gastrocnemius i närheten av skenbenet tillåter tumörtillväxt i två naturliga ES miljöer – muskler och ben – och leda till fjärrmetastaser till platser typiskt påverkas i människor. 18 Därigenom denna modell rekapitulerar noggrant metastaserande processer som sker i ES patienter under sjukdomsförloppet.
tält "> Lokaliseringen av primära tumörer i den nedre bakdelen underlättar också exakt kontroll av blodtillförsel till tumörvävnad. Femoralartärlinje ligering (FAL) är en väl etablerad teknik utnyttjas i angiogenes forskning för att blockera blodflödet till distala regioner av benet och undersöka vävnads vaskularisering som svar på ischemi. 19,20 Viktigt den initiala nedgången i blodflödet följs av säkerheter behållaröppningen och vävnads reperfusion observer ungefär tre dagar efter FAL. 20 Således när de utförs i en tumörbärande lem, denna modell åter hypoxi / reperfusion händelser som förekommer naturligt i snabbt växande tumörer och möjliggör utsläpp av metastatiska tumörceller på grund av återställande av perfusion till den nedre bakdelen via nyöppnade kollaterala kärl. 21 Viktigt denna procedur måste utföras när tumörstorleken är tillräckligt liten för att förhindra överdriven hypoxi i tumörer kontroll (vanligen vid tumörbärande kalv volUME av 150-250 mm 3), se signifikanta skillnader i tumörhypoxi mellan kontroll och FAL-behandlade grupper.Förutom längd övervakning av effekten av hypoxi på ES latens och frekvens av metastaser, denna modell gör det också möjligt för insamling av vävnader och utvecklingen av nya cellinjer från både primära tumörer och metastaser. Viktigt är tidigare arbete fastställt att metastaser-härledda cellinjer uppvisar förbättrad metastatisk potential på återinförande till djur, vilket tyder på att tumörspridning är förknippad med permanenta förändringar i tumörcellen fenotypen och därigenom validera användningen av dessa cellinjer för att dechiffrera metastaser processer. 18 Tillsammans kan dessa modeller nu användas för genetiska och molekylära analyser som krävs för att identifiera hypoxi-inducerad metastaserande vägar.
Som hypoxi är en pro-metastaserande faktor öka malignitet av olika tumors kan vår modell kan användas som en plattform för att undersöka vilken roll hypoxi i andra tumörtyper som naturligt utvecklas i armar och ben, såsom osteosarkom och rabdomyosarkom. 21-23 Dessutom kan tillämpas ett liknande tillvägagångssätt för maligniteter som växer i andra anatomiska platser med en väldefinierad väg blodtillförsel. I slutändan kan modellen ändras och dess användbarhet utökas ytterligare, beroende på individuella forskningsbehov.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vår modell innebär en jämförelse av metastaser i två experimentella grupper – en kontrollgrupp, där tumörer får utvecklas i bakbenet, följt av amputation på att nå en kalv volym av 250 mm 3, och en hypoxi-exponerade gruppen, där tumor- bärande bakben underkastas FAL med samma volym, följt av amputation 3 dagar senare. Även om det i dessa experiment FAL-behandlade tumörer amputerade med en viss fördröjning, jämfört med kontrolltumörer, inte deras storlek inte öka under perioden 3 dagar me…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Institutes of Health (NIH) grants: UL1TR000101 (previously UL1RR031975) through the Clinical and Translational Science Awards Program, 1RO1CA123211, 1R03CA178809, R01CA197964 and 1R21CA198698 to JK. MRI was performed in the Georgetown-Lombardi Comprehensive Cancer Center’s Preclinical Imaging Research Laboratory (PIRL) and tissue processing in the Georgetown-Lombardi Comprehensive Cancer Center’s Histopathology & Tissue Shared Resource, both supported by NIH/NCI grant P30-CA051008. The authors thank Dan Chalothorn and James E. Faber, Department of Cell Biology and Physiology, University of North Carolina at Chapel Hill, for their assistance with postmortem x-ray angiography, and providing insight and expertise on collaterogenesis.
Materials
| SK-ES1 Human Ewing sarcoma (ES) cells | ATCC | ||
| TC71 Human ES cells | Kindly provided from Dr. Toretsky | ||
| McCoy's 5A (modified) Medium | Gibco by Life Technologies | 12330-031 | |
| RPMI-1640 | ATCC | 30-2001 | |
| PBS | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442-500mL | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Gibco by Life Technologies | 25200-056 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco by Life Technologies | 15140-122 | |
| Fungizone® Antimycotic | Gibco by Life Technologies | 15290-018 | |
| MycoZap™ Prophylactic | Lonza | VZA-2032 | |
| Collagen Type I Rat tail high concetration | BD Biosciences | 354249 | |
| SCID/beige mice | Harlan or Charles River | 250 (Charles River) or 18602F (Harlan) | |
| 1 mL Insulin syringes with permanently attached 28G½ needle | BD | 329424 | |
| Saline (0.9% Sodium Chloride Injection, USP) | Hospira, INC | NDC 0409-7984-37 | |
| Digital calipers | World Precision Instruments, Inc | 501601 | |
| Surgical Tools | Fine Science Tools | ||
| Rimadyl (Carprofen) Injectable | Zoetis | ||
| Hypoxyprobe-1 (Pimonidazole Hydrochloride solid) | HPI, Inc | HP-100mg | |
| hypoxyprobe-2 (CCI-103F-250mg) | HPI, Inc | CCI-103F-250mg | |
| Povidone-iodine Swabstick | PDI | S41350 | |
| Sterile alcohol prep pad | Fisher HealthCare | 22-363-750 | |
| LubriFresh P.M. (eye lubricant ointment) | Major Pharaceuticals | NDC 0904-5168-38 | |
| VWR Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier | VWR | 56617-014 | |
| Oster Golden A5 Single Speed Vet Clipper with size 50 blade | Oster | 078005-050-002 (clipper), 078919-006-005 (blade) | |
| Nair Lotion with baby oil | Church & Dwight Co., Inc. | ||
| Silk 6-0 | Surgical Specialties Corp | 752B | |
| Prolene (polypropylene) suture 6-0 | Ethicon | 8680G | |
| Vicryl (Polyglactin 910) suture 4-0 | Ethicon | J386H | |
| Fisherbrand Applicators (Purified cotton) | Fisher Scientific | 23-400-115 | |
| GelFoam Absorbable Dental Sponges – Size 4 | Pfizer Pharmaceutical | 9039605 | |
| Autoclip Wound Clip Applier | BD | 427630 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Autoclip remover | BD | 427637 | |
| Aound clip | BD | 427631 | |
| MRI 7 Tesla | Bruker Corporation | ||
| Paravision 5.0 software | Bruker Corporation | ||
| CO2 Euthanasia system | VetEquip | ||
| 25G 5/8 Needle (for heart-puncture) | BD | 305122 | |
| 0.1 mL syringe (for heart-puncture) | Terumo | SS-01T | |
| K3 EDTA Micro tube 1.3ml | Sarstedt | 41.1395.105 | |
| 10% Neutral Buttered Formalin | Fisher Scientific | SF100-4 |
References
- Lessnick, S. L., Ladanyi, M. Molecular pathogenesis of Ewing sarcoma: new therapeutic and transcriptional targets. Annu Rev Pathol. 7, 145-159 (2012).
- Ladenstein, R. Primary disseminated multifocal Ewing sarcoma: results of the Euro-EWING 99 trial. J Clin Oncol. 28, 3284-3291 (2010).
- Dunst, J., Ahrens, S., Paulussen, M., Burdach, S., Jurgens, H. Prognostic impact of tumor perfusion in MR-imaging studies in Ewing tumors. Strahlenther Onkol. 177, 153-159 (2001).
- Aryee, D. N. Hypoxia modulates EWS-FLI1 transcriptional signature and enhances the malignant properties of Ewing’s sarcoma cells in vitro. 암 연구학. 70, 4015-4023 (2010).
- Knowles, H. J., Schaefer, K. L., Dirksen, U., Athanasou, N. A. Hypoxia and hypoglycaemia in Ewing’s sarcoma and osteosarcoma: regulation and phenotypic effects of Hypoxia-Inducible Factor. BMC cancer. 10, 372 (2010).
- Tilan, J. U. Hypoxia shifts activity of neuropeptide Y in Ewing sarcoma from growth-inhibitory to growth-promoting effects. Oncotarget. 4, 2487-2501 (2013).
- Franzius, C. Successful high-resolution animal positron emission tomography of human Ewing tumours and their metastases in a murine xenograft model. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 33, 1432-1441 (2006).
- Hauer, K. DKK2 mediates osteolysis, invasiveness, and metastatic spread in Ewing sarcoma. 암 연구학. 73, 967-977 (2012).
- Manara, M. C. Preclinical in vivo study of new insulin-like growth factor-I receptor–specific inhibitor in Ewing’s sarcoma. Clin Cancer Res. 13, 1322-1330 (2007).
- Scotlandi, K. Murine model for skeletal metastases of Ewing’s sarcoma. J Orthop Res. 18, 959-966 (2000).
- Vormoor, J. Establishment of an in vivo model for pediatric Ewing tumors by transplantation into NOD/scid mice. Pediatr Res. 49, 332-341 (2001).
- Picarda, G. Preclinical evidence that use of TRAIL in Ewing’s sarcoma and osteosarcoma therapy inhibits tumor growth, prevents osteolysis, and increases animal survival. Clin Cancer Res. 16, 2363-2374 (2010).
- Vormoor, B. Development of a preclinical orthotopic xenograft model of ewing sarcoma and other human malignant bone disease using advanced in vivo imaging. PLoS One. 9, e85128 (2014).
- Wang, Y. Platelet-derived growth factor receptor beta inhibition increases tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) sensitivity: imatinib and TRAIL dual therapy. Cancer. 116, 3892-3902 (2010).
- Wang, Y. X. Inhibiting platelet-derived growth factor beta reduces Ewing’s sarcoma growth and metastasis in a novel orthotopic human xenograft model. In Vivo. 23, 903-909 (2009).
- Odri, G. A. Zoledronic acid as a new adjuvant therapeutic strategy for Ewing’s sarcoma patients. 암 연구학. 70, 7610-7619 (2010).
- Merchant, M. S. Interferon gamma enhances the effectiveness of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor agonists in a xenograft model of Ewing’s sarcoma. 암 연구학. 64, 8349-8356 (2004).
- Hong, S. H. High neuropeptide Y release associates with Ewing sarcoma bone dissemination – in vivo model of site-specific metastases. Oncotarget. 6, 7151-7165 (2015).
- Lee, E. W. Neuropeptide Y induces ischemic angiogenesis and restores function of ischemic skeletal muscles. J Clin Invest. 111, 1853-1862 (2003).
- Tilan, J. U. Platelet neuropeptide Y is critical for ischemic revascularization in mice. FASEB J. , (2013).
- Toffoli, S., Michiels, C. Intermittent hypoxia is a key regulator of cancer cell and endothelial cell interplay in tumours. The FEBS journal. 275, 2991-3002 (2008).
- Das, B. Hypoxia enhances tumor stemness by increasing the invasive and tumorigenic side population fraction. Stem cells (Dayton, Ohio). 26, 1818-1830 (2008).
- Arndt, C. A., Rose, P. S., Folpe, A. L., Laack, N. N. Common musculoskeletal tumors of childhood and adolescence. Mayo Clin Proc. 87, 475-487 (2012).
- Mendoza, A. A novel noninvasive method for evaluating experimental lung metastasis in mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 52, 584-589 (2013).
- Feldman, D. B., Seely, J. C. . Necropsy Guide: Rodents and the Rabbit. , (1988).
- Parkinson, C. M. Diagnostic necropsy and selected tissue and sample collection in rats and mice. J Vis Exp. , (2011).
- Raymond, A. K., Lazar, A. J., PP, L. i. n., S, P. a. t. e. l. . Bone Sarcoma. , (2013).
- Dietel, M., Arps, H., Gerding, D., Trapp, M., Niendorf, A. Establishment of primary cell cultures: experiences with 155 cell strains. Klin Wochenschr. 65, 507-512 (1987).
- Varghese, A. J., Gulyas, S., Mohindra, J. K. Hypoxia-dependent reduction of 1-(2-nitro-1-imidazolyl)-3-methoxy-2-propanol by Chinese hamster ovary cells and KHT tumor cells in vitro and in vivo. 암 연구학. 36, 3761-3765 (1976).
