No modelo in vivo para o ensaio do efeito de hipoxia em metástase tumoral
Summary
This manuscript describes the development of an animal model that allows for the direct testing of the effects of tumor hypoxia on metastasis and the deciphering the mechanisms of its action. Although the experiments described here focus on Ewing sarcoma, a similar approach can be applied to other tumor types.
Abstract
Hypoxia has been implicated in the metastasis of Ewing sarcoma (ES) by clinical observations and in vitro data, yet direct evidence for its pro-metastatic effect is lacking and the exact mechanisms of its action are unclear. Here, we report an animal model that allows for direct testing of the effects of tumor hypoxia on ES dissemination and investigation into the underlying pathways involved. This approach combines two well-established experimental strategies, orthotopic xenografting of ES cells and femoral artery ligation (FAL), which induces hindlimb ischemia. Human ES cells were injected into the gastrocnemius muscles of SCID/beige mice and the primary tumors were allowed to grow to a size of 250 mm3. At this stage either the tumors were excised (control group) or the animals were subjected to FAL to create tumor hypoxia, followed by tumor excision 3 days later. The efficiency of FAL was confirmed by a significant increase in binding of hypoxyprobe-1 in the tumor tissue, severe tumor necrosis and complete inhibition of primary tumor growth. Importantly, despite these direct effects of ischemia, an enhanced dissemination of tumor cells from the hypoxic tumors was observed. This experimental strategy enables comparative analysis of the metastatic properties of primary tumors of the same size, yet significantly different levels of hypoxia. It also provides a new platform to further assess the mechanistic basis for the hypoxia-induced alterations that occur during metastatic tumor progression in vivo. In addition, while this model was established using ES cells, we anticipate that this experimental strategy can be used to test the effect of hypoxia in other sarcomas, as well as tumors orthotopically implanted in sites with a well-defined blood supply route.
Introduction
Sarcoma de Ewing (ES) é uma neoplasia agressiva que afectam as crianças e adolescentes. 1 Os tumores se desenvolvem em tecidos moles e ossos, comumente nos membros. Embora a presença de metástases é o factor adverso mais forte único prognóstico para pacientes ES, os mecanismos subjacentes ao seu desenvolvimento permanecem obscuros. 2 tumor hipoxia é um dos poucos factores implicados na progressão ES. Em pacientes ES, a presença de áreas não perfundidas no interior do tecido do tumor está associada com mau prognóstico. 3 In vitro, a hipoxia aumenta a capacidade de invasão de células ES e desencadeia a expressão de genes pró-metastáticos. 4-6 No entanto, apesar destas linhas de evidência, nenhuma prova direta para a progressão ES induzido por hipoxia ea propagação existe. Além disso, os mecanismos pelos quais a hipoxia exerce tais efeitos são, presentemente, desconhecido. Por isso, criamos um modelo in vivo para preencher a lacuna entre o existente dados in vitro e obser clínicavações. Este sistema modelo permite testar directa dos efeitos de hipoxia em tumores que ocorrem no seu ambiente natural, utilizando imagiologia de ressonância magnética (MRI) para seguir a progressão tumoral e metástases in vivo, em combinação com análise ex vivo patológicas e moleculares (Figura 1).
Uma vez que nenhum transgénico modelo estabelecido de ES está actualmente disponível, os estudos in vivo sobre as propriedades metastáticas destes tumores dependem de injeções de células humanas em ratinhos imunocomprometidos. Enquanto o uso de animais com deficiência imunologicamente pode subestimar o impacto do sistema imune na progressão da doença, a capacidade para utilizar células humanas aumenta tradutibilidade de tais estudos. Entre os diferentes modelos de xenotransplante, injeções sistêmicas na veia da cauda são mais fáceis de executar, mas omitem os passos iniciais da intravasation célula tumoral e fugir do local primário do crescimento. 12/07 Por outro lado, orthoto xeno pic, que envolve injeções de células tumorais em ossos (fêmur, costela) ou nos músculos, é mais um desafio técnico, mas também biologicamente mais relevantes para câncer humano. 13-16 eutanásia dos animais No entanto, no passado, a altas taxas de morbidade associada a um rápido crescimento de tumores primários foi frequentemente necessária antes do desenvolvimento de metástases. Neste estudo, que empregou um modelo previamente estabelecido de injecções de células no músculo gastrocnémio seguida por excisão do tumor primário resultante combinada com a monitorização longitudinal de progressão metastático por MRI. 17,18 Essas injecções no músculo gastrocnémio em estreita proximidade com a tíbia permitir o crescimento do tumor em dois ambientes naturais ES – músculos e ossos – e resultar em metástases para locais distantes normalmente atingidas em seres humanos. 18 Deste modo, este modelo recapitula com precisão os processos metastáticos que ocorrem em pacientes ES durante a progressão da doença.
tenda "> A localização de tumores primários no membro posterior inferior também facilita o controle preciso do fornecimento de sangue ao tecido do tumor. A ligação da artéria femoral (FAL) é uma técnica bem estabelecida utilizada na investigação da angiogénese para bloquear o fluxo de sangue para as regiões distais do a perna e investigar vascularização do tecido em resposta a isquemia 19,20. é importante ressaltar que a queda inicial no fluxo sanguíneo é seguido por abertura vaso colateral e reperfusão de tecidos observa-se aproximadamente 3 dias após FAL. 20 Assim, quando realizada em um membro portador de tumor, este modelo recria eventos hipoxia / reperfusão que ocorrem naturalmente nos tumores de crescimento rápido e permite o escape de células tumorais metastáticas, devido ao restabelecimento da perfusão para o membro posterior inferior através de vasos colaterais recentemente abertas. 21 importante, este processo deve ser executado quando o tamanho do tumor está pequena o suficiente para evitar a excessiva hipoxia em tumores de controlo (tipicamente no bezerro vol portador de tumorume de 150-250 mm3), garantindo diferenças significativas nos níveis de hipoxia tumor entre grupos de controlo e tratados com FAL.Além disso a monitorização longitudinal do efeito de hipoxia na latência ES e a frequência de metástases, este modelo também permite a recolha de tecidos e o desenvolvimento de novas linhas de células de ambos os tumores primários e metástases. Importante, trabalho anterior demonstrou que as linhas celulares metástases derivadas exibem potencial metastático melhorada mediante a reintrodução para animais, indicando que a disseminação do tumor está associada com alterações permanentes no fenótipo de células de tumor, e validando assim a utilização destas linhas celulares para decifrar os processos metastáticos. 18 Em conjunto, estes modelos podem agora ser usados para as análises genéticas e moleculares necessários para a identificação de vias metastáticos induzida por hipoxia.
Como a hipóxia é um factor pró-metastático melhorar a malignidade de vários tumors, o nosso modelo pode ser usado como uma plataforma para investigar o papel de hipoxia em outros tipos de tumores que se desenvolvem naturalmente nos membros, tais como o osteossarcoma e rabdomiossarcoma. 21-23 Por outro lado, uma abordagem similar pode ser aplicada a outras doenças malignas que crescem em localizações anatómicas com um percurso bem definido de fornecimento de sangue. Em última análise, o modelo pode ser modificada e a sua utilidade mais alargado, dependendo das necessidades individuais de investigação.
Protocol
Representative Results
Discussion
O nosso modelo envolve a comparação de metástases em dois grupos experimentais – um grupo de controlo, onde os tumores podem desenvolver-se no membro posterior seguido de amputação, ao atingir um volume de vitelo de 250 mm, 3, e um grupo exposto por hipoxia, em que o tumor- dos membros posteriores rolamento é submetido a FAL no mesmo volume, seguido por amputação 3 dias mais tarde. Embora nestas experiências os tumores tratados com FAL são amputados com um ligeiro atraso, em comparação com os tumo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Institutes of Health (NIH) grants: UL1TR000101 (previously UL1RR031975) through the Clinical and Translational Science Awards Program, 1RO1CA123211, 1R03CA178809, R01CA197964 and 1R21CA198698 to JK. MRI was performed in the Georgetown-Lombardi Comprehensive Cancer Center’s Preclinical Imaging Research Laboratory (PIRL) and tissue processing in the Georgetown-Lombardi Comprehensive Cancer Center’s Histopathology & Tissue Shared Resource, both supported by NIH/NCI grant P30-CA051008. The authors thank Dan Chalothorn and James E. Faber, Department of Cell Biology and Physiology, University of North Carolina at Chapel Hill, for their assistance with postmortem x-ray angiography, and providing insight and expertise on collaterogenesis.
Materials
| SK-ES1 Human Ewing sarcoma (ES) cells | ATCC | ||
| TC71 Human ES cells | Kindly provided from Dr. Toretsky | ||
| McCoy's 5A (modified) Medium | Gibco by Life Technologies | 12330-031 | |
| RPMI-1640 | ATCC | 30-2001 | |
| PBS | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442-500mL | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Gibco by Life Technologies | 25200-056 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco by Life Technologies | 15140-122 | |
| Fungizone® Antimycotic | Gibco by Life Technologies | 15290-018 | |
| MycoZap™ Prophylactic | Lonza | VZA-2032 | |
| Collagen Type I Rat tail high concetration | BD Biosciences | 354249 | |
| SCID/beige mice | Harlan or Charles River | 250 (Charles River) or 18602F (Harlan) | |
| 1 mL Insulin syringes with permanently attached 28G½ needle | BD | 329424 | |
| Saline (0.9% Sodium Chloride Injection, USP) | Hospira, INC | NDC 0409-7984-37 | |
| Digital calipers | World Precision Instruments, Inc | 501601 | |
| Surgical Tools | Fine Science Tools | ||
| Rimadyl (Carprofen) Injectable | Zoetis | ||
| Hypoxyprobe-1 (Pimonidazole Hydrochloride solid) | HPI, Inc | HP-100mg | |
| hypoxyprobe-2 (CCI-103F-250mg) | HPI, Inc | CCI-103F-250mg | |
| Povidone-iodine Swabstick | PDI | S41350 | |
| Sterile alcohol prep pad | Fisher HealthCare | 22-363-750 | |
| LubriFresh P.M. (eye lubricant ointment) | Major Pharaceuticals | NDC 0904-5168-38 | |
| VWR Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier | VWR | 56617-014 | |
| Oster Golden A5 Single Speed Vet Clipper with size 50 blade | Oster | 078005-050-002 (clipper), 078919-006-005 (blade) | |
| Nair Lotion with baby oil | Church & Dwight Co., Inc. | ||
| Silk 6-0 | Surgical Specialties Corp | 752B | |
| Prolene (polypropylene) suture 6-0 | Ethicon | 8680G | |
| Vicryl (Polyglactin 910) suture 4-0 | Ethicon | J386H | |
| Fisherbrand Applicators (Purified cotton) | Fisher Scientific | 23-400-115 | |
| GelFoam Absorbable Dental Sponges – Size 4 | Pfizer Pharmaceutical | 9039605 | |
| Autoclip Wound Clip Applier | BD | 427630 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Autoclip remover | BD | 427637 | |
| Aound clip | BD | 427631 | |
| MRI 7 Tesla | Bruker Corporation | ||
| Paravision 5.0 software | Bruker Corporation | ||
| CO2 Euthanasia system | VetEquip | ||
| 25G 5/8 Needle (for heart-puncture) | BD | 305122 | |
| 0.1 mL syringe (for heart-puncture) | Terumo | SS-01T | |
| K3 EDTA Micro tube 1.3ml | Sarstedt | 41.1395.105 | |
| 10% Neutral Buttered Formalin | Fisher Scientific | SF100-4 |
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