우리는 임상 번역 잠재력 개발 된 높은 처리량, 멀티 플렉스 및 대상 단백체 뇌척수액 (CSF) 분석에 대해 설명합니다. 시험은 예컨대 아포지 단백질 E 변형 (E2, E3 및 E4)과 같은 신경 퇴행에 대한 잠재적 마커 및 위험 인자를 정량하고, 그 대립 유전자 발현을 측정 할 수있다.
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방법 논문
높은 처리량, 멀티 플렉스 및 대상 단백체 CSF 분석은 퇴행성 신경 바이오 마커 및 아포 지단백 E 이소 상태를 정량화하기
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
많은 신경 퇴행성 질환은 여전히 효과적인 치료법이 결여되어있다. 식별하고 이러한 질병을 분류하기위한 신뢰할 수있는 바이오 마커는 미래의 새로운 치료법의 개발에 중요하다. 종종 잠재적 인 새로운 바이오 마커는 그들의 개발과 높은 비용의 한계로 병원으로하지 않습니다. 그러나, 액체 크로마토 그래피 - 탠덤 모니터링 다양한 반응을 이용하여 표적 단백질 체학은 / 질량 분석 즉, 삼중 사중 극자 질량 분석기를 사용하여 (MRM 된 LC-MS / MS)를 빠르게 진단 실험실로 임상 번역 바이오 마커를 평가하고 검증하는 데 사용될 수있는 하나의 방법이다 . 전통적으로,이 플랫폼은 임상 실험실에서 작은 분자의 측정에 광범위하게 사용되고 있지만, 그것은 그것을 ELISA (효소 결합 Immunosor에 매력적인 대안을 만드는 단백질을 분석 할 수있는 잠재적 인굴곡 량 법) 방법을 기반. 우리는 E 이성체 4 (ApoE4로)를 아포지 단백질 공지 된 위험 인자의 검출 및 정량화를 포함한 치매 다중화 마커를 측정하는 방법을 프로테오믹스 타겟 여기서 설명한다.
번역 분석에 적합하게하기 위하여, 신속한 간단한 매우 특정하고 비용 효율적인 설계된다. 이를 달성하기 위해, 분석법 개발의 모든 단계들이 분석되어 각각의 단백질과 조직에 대해 최적화되어야한다.이 방법은 번역 타겟 프로테오믹스 MRM 된 LC-MS / MS를 개발하는 다양한 팁과 포함하는 일반적인 흐름을 설명 .
방법 개발 검출을위한 MS를 보정 트립신 quantotypic 펩티드의 사용자 지정 합성 버전을 사용하여 최적화 한 다음 이전에 MS의 분석 크로마토 그래피 분리에 내인성 펩티드의 정확한 식별을 결정하기 위해 CSF로 급증한다. 압솔뤼을 달성하기 위해TE 정량 짧은 아미노산 서열 태그에 트립신 절단 부위를 포함하는 펩티드와 안정 동위체 표지 내부 표준 버전은, 상기 분석에 포함된다.
서론
알츠하이머 병, 루이체 치매 및 파킨슨 질환과 같은 신경 퇴행성 질환의 증가 효과는 많은 국가 하나의 사회 경제적 문제가되고있다. 식별 및 질병의 초기 단계에 환자를 분류하고, 잠재적 인 새로운 치료를 모니터링하는데 사용될 수있는 추가의 바이오 마커가 필요하다. 이 방법의 전반적인 목표는 신경 퇴행의 가능성 CSF 마커의 유효성을 검사하는 간소화 된 경제 및 빠른 방법에 대한 일반적인 파이프 라인을 만드는 것입니다. 이론적 디스커버리 실험에서 여러 잠재적 바이오 마커 단백질을 평가하기 쉽게 수정할 수있는 방법으로 타겟 프로테오믹스 또는 펩티드 MRM LC-MS / MS를 사용하는 것이다. 이러한 더 빠른 크로마토 그래피 분리 (<10 분) 및 평가를 통해 다중화 될 수있다. 신경 퇴행성 바이오 마커이 다중 화면 내에서, 우리는 알려진 치매 위험 인자의 아포지 단백질 이소 E4 (ApoE4로)를 포함했다 그래서 우리는 캘리포니아N이 별개의 유전자형이 테스트에 대한 필요성을 제거함으로써 동시에 그 상태 발현 수준을 결정한다. LC MS / MS 일상적 정확하게 예컨대 ELISA 또는 방사선 면역 측정법 (RIA) 등의 다른 방법보다 작은 분자를 정량 선호하는 방법으로 사용된다. 분석 단백질 MS 기술의 사용이 시프트는 면역 기반 기술의 문제에 의해 주로 ....
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프로토콜
참고 :. 여기에 설명 된 전체 프로토콜의 개략적 인이 Fi를 gure 1에 제시되어이 방법의 개발에 사용 된 모든 샘플은 흑자 임상 진단 샘플이며 런던 블룸 스 버리 윤리위원회의 윤리 승인을 가지고있다.
평가를 위해 타겟팅 된 CSF의 MRM LC-MS / MS 분석. 후보 표지자 펩타이드 생성의 전체적인 과정을 나타낸 도식도 1 단백질 타겟으로부터 선택된다. 맞춤 합성 펩티드의 사용을 통해, 타겟팅 된 LC-MS / MS 다중 방법이 생성된다. 평가 후 분석은 신경 퇴행의 가능성이 마커의 효능을 평가하는데 사용될 수있다.
1. 펩타이드 선택 및 디자인
참고 : 마커 펩타이드 기준이 고유해야한다는 것입니다 (proteotypic 강한)과....
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결과
전술 한 방법을 사용하여, 54 단백질 74 펩티드로 이루어진 높은 처리량을 10 분 다중 분석이 신경 퇴행성 질환 알츠하이머 병 및 루이체 치매 (LBD) (8).도 3의 마커에 대한 분석으로 개발되었다 게시 다중화 크로마토 그램이다 이전에 8 분석에서 중요한 펩타이드 마커. 분석 및 정량 전이에 포함 된 펩티드. 표 2에 주어진이 방법에 의해 생성 된 데이터는 관련 안정 동위 원소 표지 된 내부 표준으로 표준화 된 비율을 제공한다. 이들 값은 절대 pmol의 / 100 μL의 CSF 농도를 결정하는 표준 곡선을 넣을 수있다. 이들 값은 다음 통계적 임상 샘플의 변화를 분석 할 수있다.
이전 8 74 PE 정량 한 바와 같이,이 CSF 분석.......
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토론
모든 MS 기반 분석에서와 같이, 상기 방법에서 중요한 단계는 내부 표준 물질의 적정하고 정확한 양의 측정이다. 절대 정량이 사용되는 경우, 표준 곡선 아군 펩티드의 정확한 양 또한 중요하다.
우리의 분석은 CSF 또는 종래 MS 분석에 정리하거나 탈염 같이 임의의 유형의 사용의 석출을 필요로하지 않는 - 그것은 전적으로 한 냄비 반응 방법이다. 인해 CSF의 작은 부피와 한정된 복잡도 (플라즈마에 비해)에, 이들 단계하여 분석을 단순화하고 진단 설정에 번역이 더 적합 최종 프로토콜에서 제거 될 수 있음이 밝혀졌다. 주 열 분석하고 MS 방법에서 용매를 지연 미리 열의 개재물 500 개 이상의 샘플에 대한 실행시 MS 감도를 유지하기에 충분한 것으로 보인다. 분석-UPLC runni로NG 시간은 명백하게 행렬 다이제스트 CSF에서 정확한 피크를 식별하는 데 중요하다 짧다.
이 아군은 합성 펩티드의 사용과 표준 곡선에 의해 달.......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 국립보건연구소(National Institute for Health Research), 그레이트 오몬드 스트리트 병원(Great Ormond Street Hospital)의 생물의학 연구 센터(Biomedical Research Centre), UCL 아동 건강 연구소(UCL Institute of Child Health)의 UCL 생물 질량 분석 센터(UCL Biological Mass Spectrometry Centre)의 GOSomics 연구 이니셔티브를 통해 Szeban Peto Foundation의 기부금으로 지원되고 촉진되었습니다. 치매 연구 센터(Dementia Research Centre)는 영국 알츠하이머 연구 조정 센터입니다. 저자들은 영국 알츠하이머 연구소(Alzheimer's Research UK), NIHR 퀸 스퀘어 치매 생물의학 연구단(NIHR Queen Square Dementia Biomedical Research Unit), UCL/H 생물의학 연구 센터(UCL/H Biomedical Research Centre) 및 레너드 울프슨 실험 신경학 센터(Leonard Wolfson Experimental Neurology Centre)의 지원을 인정한다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 아세토니트릴(ACN), LC-MS 등급 | Fisher | A955-1 | |
| 포름산, LC-MS 등급, | Fisher | A117-50 | |
| 디티오트레이톨 (DTT) | 시그마 | D5545 - 5 g | |
| 염산, 37% w/w | VWR | BDH3028 - 2.5 LG | |
| 요오도아세트아미드 | 시그마 | I1149 - 수 | |
| S318-500 | |||
| 트립신, 염기서열분석 등급, 변형 | Promega | V5113 | |
| 트리플루오로아세트산(TFA), LC-MS 등급 | Fisher | A116-50 | |
| 우레아 | 시그마 | U0631- 500g | |
| 물, LC-MS ULTRA 크로마솔프 | 플루카 | 14263 | |
| 맞춤형 합성 펩타이드 탈염 1-4 mg | Genscript | 맞춤형 | |
| 헤비 라벨링 아미노산 [13C; 15N] 맞춤형 펩타이드 | Genscript | 맞춤형 | |
| ASB 14 | Merck Millipore | 182750 - 25g | |
| Thiourea | Sigma | T7875 - 500g | |
| Tris base | Sigma | T6066 | |
| VanGuard precolumn | Waters | 186007125 | |
| Cortecs UPLC C18 + 1.6 μ 엠 2.1 x 50 mm 칼럼 | Waters | 186007114 | |
| Yeast Enolase | 시그마 | E6126 | |
| 300 μ l 클리어 스크류 탑 글라스 바이알 | Fisher scientific | 03-FISV | |
| Y 슬릿 스크류 캡 | Fisher scientific | 9SCK-(B)-ST1X | |
| 동결 건조기 | Edwards Mudulyo | Mudulyo 시스템 | |
| 집중 장치/속도 진공 | Eppendof | 집중 장치 plus 5301 | |
| Xevo -TQ-S 질량분석기 | Waters | ||
| Acquity UPLC 시스템 | Waters |
참고문헌
- Prince, P. M., Guerchet, D. M., Prina, D. M., et al. Policy Brief: The Global Impact of Dementia 2013-2050. , Alzheimers Disease International. Available from: http://www.alz.co.uk/research/G8-policy-brief (2013).
- Hirtz, C., et al.
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