Summary

Kapillarelektroforese til Monitor peptid podning på Chitosan Film i Real Time

Published: October 26, 2016
doi:

Summary

Free solution capillary electrophoresis is a fast, cheap and robust analytical method that enables the quantitative monitoring of chemical reactions in real time. Its utility for rapid, convenient and precise analysis is demonstrated here through analysis of covalent peptide grafting onto chitosan films for improved cell adhesion.

Abstract

Free-opløsning kapillarelektroforese (CE) adskiller analytter, generelt ladede forbindelser i opløsning ved anvendelse af et elektrisk felt. Sammenlignet med andre analytiske separationsteknikker, såsom kromatografi, CE er billig, robust og effektivt kræver ingen prøveforberedelse (for en række komplekse naturlige matricer eller polymere prøver). CE er hurtig og kan anvendes til at følge udviklingen i blandinger i realtid (fx kemisk reaktionskinetik), som de observerede de adskilte forbindelser signaler er direkte proportional med deres mængde i opløsning.

Her er effektiviteten af ​​CE demonstreret til overvågning af kovalent podning af peptider på chitosan film for efterfølgende biomedicinske anvendelser. Chitosan er antimikrobielle og biokompatible egenskaber gør det til et attraktivt materiale til biomedicinske applikationer såsom cellevækst substrater. Covalent podning peptid RGDS (arginin – glycin -asparaginsyre – serin) på overfladen af ​​chitosan film til formål at forbedre cellevedhæftning. Historisk set har kromatografi og aminosyreanalyse blevet anvendt til at tilvejebringe en direkte måling af mængden af ​​podet peptid. Men den hurtige adskillelse og fravær af prøvefremstilling tilvejebragt af CE muliggør lige så nøjagtige, men samtidig realtidsovervågning af peptidet podning processen. CE er i stand til at adskille og kvantificere de forskellige komponenter i reaktionsblandingen: den (ikke-podet) peptid og de kemiske koblingsmidler. På denne måde anvendelsen af ​​CE resulterer i forbedrede film til efterfølgende anvendelser.

Chitosan film blev karakteriseret gennem faststof NMR (kernemagnetisk resonans) spektroskopi. Denne teknik er mere tidskrævende og kan ikke anvendes i realtid, men giver en direkte måling af peptidet og dermed validerer CE teknik.

Introduction

Gratis løsning kapillarelektroforese (CE) er en teknik, der adskiller forbindelser i løsninger baseret på deres ladning-til-friktion-forholdet 1,2. Charge-til-størrelsesforhold nævnes ofte i litteraturen, men denne forenkling gælder ikke for polyelektrolytter, herunder polypeptider i dette arbejde, og blev også vist sig ikke at være hensigtsmæssigt for små organiske molekyler 3. CE adskiller sig fra andre separationsteknikker i, at den ikke har en stationær fase, kun en baggrund elektrolyt (normalt en puffer). Dette gør det muligt teknik til at være robust i sin evne til at analysere en lang række prøver med komplekse matricer 4 såsom plantefibre 5, gæring brygger 6 podning på syntetiske polymerer 7, mad prøver 8 og næppe opløselige peptider 9 uden kedelige prøveforberedelse og oprensning. Dette er især vigtigt for komplekse polyelektrolytter som har opløsnings-spørgsmål (such som chitosan 10 og gellangummi 11), og derfor eksistere som aggregeret eller udfældes i opløsning, og med succes er blevet analyseret uden prøve filtrering. Endvidere er analysen af sukkerarter i morgenmadscerealier involveret injicere prøver med partikler morgenmadsprodukter prøver udfældes i vand 8. Dette omfatter også en analyse af forgrenede polyelektrolytter eller copolymerer 12,13. Omfattende arbejde er også blevet gennemført i udviklingen af CE teknikker specielt til analyse af proteiner for proteomics 14, chirale adskillelse af naturlige eller syntetiske peptider 15 og mikrochip separationer af proteiner og peptider 16. Eftersom adskillelsen og analysen finder sted i et kapillarrør, er kun små volumener af prøve og opløsningsmidler anvendt som muliggør CE at have en lavere driftsomkostninger end andre separationsteknikker, herunder kromatografi 5,6,17. Da adskillelsen af ​​CE er hurtig, det tillader monitoring af reaktionskinetik. Dette blev demonstreret i forbindelse med podning af peptider på chitosan film til forbedret celleadhæsion 18.

Chitosan er et polysaccharid afledt fra N -deacetylation af chitin. Chitosan film kan anvendes til forskellige biomedicinske applikationer såsom bioklæbemidler 19 og celle vækstsubstrater 18,20, grundet chitosan s biokompatibilitet 21. Cell tilknytning til specifikke ekstracellulære matrix proteiner, såsom fibronectin, collagener og laminin, er direkte forbundet med overlevelse af cellerne 22. Især forskellige celletyper kræver ofte fastgørelse til forskellige ekstracellulære matrixproteiner for overlevelse og korrekt funktion. Cell tilknytning til chitosan film viste sig at blive styrket gennem podning af fibronektin 23; Men forberedelse, rensning og podning af sådanne store proteiner ikke er økonomisk rentabel. Skiftevis en række små peptider have vist sig at være i stand til at efterligne egenskaberne af store ekstracellulære matrixproteiner. For eksempel peptider, såsom fibronectin mimetika RGD (arginin – glycin – asparaginsyre) og RGDS (arginin – glycin – asparaginsyre – serin) er blevet anvendt til at fremme og øge cellebinding 24. Kovalent podning af RGDS onto chitosan film resulterede i forbedret vedhæftning celle for celler er kendt for at knytte til fibronektin in vivo 18. Substituere større proteiner kan lide fibronectin med mindre peptider, der har den samme funktionalitet giver en betydelig omkostningsreduktion.

Her, peptid podning til chitosan blev udført som tidligere publiceret 18.. Som tidligere demonstreret, denne tilgang giver enkel og effektiv podning ved hjælp af koblingsmidler EDC-HCI (1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimid) og NHS (N-hydroxysuccinimid) at funktionalisere carboxylsyren af RGDS at være podet påchitosan film. To fordele ved denne podning metode er, at det ikke kræver nogen ændring af chitosan eller af peptidet, og de udføres i vandigt medium for at maksimere kompatibilitet med fremtidige cellekulturanvendelser 18,20. Som koblingsmidler og peptidet kan oplades, CE er en egnet fremgangsmåde til analyse af reaktionskinetikken. Vigtigere, analyse af reaktionskinetikken via CE muliggør real-time monitorering af podningsreaktionen og således muliggør både optimering og kvantificere graden af ​​podning.

Selv om det ikke rutinemæssigt nødvendigt, kan resultaterne af CE-analyse valideres off-line ved en direkte måling af peptidet podning på chitosan film under anvendelse faststof NMR (kernemagnetisk resonans) spektroskopi 25,26 for at demonstrere den kovalente podning af peptidet på filmen 18. Men sammenlignet med faststof NMR spektroskopi, analyse i realtid fraCE muliggør kvantificering af peptidet forbrug i realtid og dermed evnen til at vurdere kinetikken for reaktionen.

Den ovennævnte fremgangsmåde er enkel og tillader tidstro analyse af peptid podning på chitosan film med indirekte kvantificering af omfanget af podningen. Den påvist fremgangsmåde kan udvides til realtid kvantitativ vurdering af forskellige kemiske reaktioner, så længe reaktanterne eller produkterne, der skal analyseres kan oplades.

Protocol

1. Fremstilling af chitosan film Afvej 2 g iseddikesyre, komplet til 100 ml med ultrarent vand. Afvej 1,7 g chitosan pulver, tilsættes 100 ml af 2% m / m vandig eddikesyreopløsning. Der omrøres i 5 dage under omrøring bar og magnetisk omrøring plade ved stuetemperatur enten dækket med aluminiumsfolie eller i mørke. Centrifugeres chitosan dispersion ved 1.076 xg ved 23 ° C i 1 time. Saml supernatanten med en sprøjte og kassér bundfald. For hver film, alikvot 10 ml chitos…

Representative Results

CE er velegnet til overvågning af podning af peptider (f.eks RGDS) mere på chitosan film. Egnede koblingsmidler indbefatter EDC-HCI og NHS som aktiverer peptid, der skal podes på chitosan (figur 1). CE er i stand til at adskille de forskellige molekyler af interesse fra reaktionsmediet. For at tildele toppene på elektroferogrammet, rene RGDS, EDC, HCI og NHS blev opløst, injiceres og adskilt hver for sig. Efter højdepunktet opgaven blev reaktionsmediet inj…

Discussion

Enkelheden i protokollen beskrevet her gør det velegnet til udbredt anvendelse. skal dog særlig opmærksomhed, der skal betales til af følgende centrale trin.

Korrekt CE forberedelse instrument

Det er vigtigt at adskille en kendt standard umiddelbart før adskillelsen af ​​ukendte prøver (såvel som ved afslutningen af ​​en række separationer) til at kontrollere gyldigheden af ​​kapillæren og instrumentet på dagen. Denne standa…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

MG, MO’C and PC thank the Molecular Medicine Research Group at WSU for Research Seed Funding, as well as Michele Mason (WSU), Richard Wuhrer (Advanced Materials Characterisation Facility, AMCF, WSU) and Hervé Cottet (Montpellier) for discussions.

Materials

Water Millipore All water used in the experiment has to be of Milli-Q quality
Chitosan powder (medium molecular weight) Sigma-Aldrich 448877 lot MKBH1108V was used. Significant batch-to-batch variations occur with natural products such as polysaccharides
Acetic acid – Unilab Ajax Finechem 2-2.5L GL laboratory reagent
Dimethylsulfoxide Sigma-Aldrich D4540 laboratory reagent, slightly hazardous to skin, hazardous if ingested
Sodium hydroxide  Sigma-Aldrich 221465  laboratory reagent, corrosive 
RGDS  Bachem H‐1155 peptide, bought from Auspep Pty Ltd
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide  Sigma-Aldrich D80002 Irritant to skin 
N-hydroxysuccinimide  Sigma-Aldrich 130672 Irritant to skin
Sodium chloride  Ajax Finechem 466-500G laboratory reagent
Potassium chloride – Univar Ajax Finechem 384-500G analytical reagent, slight skin irritant
Disodium hydrogen phosphate – Unilab Ajax Finechem 1234-500G laboratory reagent, slight skin irritant
Potassium dihydrogen phosphate – Univar Ajax Finechem 4745-500G analytical reagent, slight skin irritant
Oligoacrylate standard custom made See reference for synthetic protocol: Castignolles, P.; Gaborieau, M.; Hilder, E. F.; Sprong, E.; Ferguson, C. J.; Gilbert, R. G. Macromol. Rapid Commun. 2006, 27, 42-46
Boric acid  BDH AnalR, Merck Pty Ltd 10058 Corrosive
Hydrochloric acid – Unilab Ajax Finechem A1367-2.5L laboratory reagent, corrosivie
Fused silica tubing Polymicro (Molex) TSP050375 Flexible fused silica capillary tubing with standard polyimide coating, 50 µm internal diameter, 363 µm outer diameter 
Agilent 7100 CE Agilent Technologies G7100CE Capillary electrophoresis instrument
Orbital shaker  IKA KS260
Electronic balance Mettler Toledo MS204S
Milli-Q Synthesis  Millipore ZMQS5VF01 Ultrapure water filtration system
Parafilm  Labtek PM966 Parrafin wax

References

  1. Muthukumar, M. Theory of electrophoretic mobility of a polyelectrolyte in semidilute solutions of neutral polymers. Electrophoresis. 17, 1167-1172 (1996).
  2. Barrat, J. L., Joanny, J. F. . in Advances in Chemical Physics, Vol Xciv Vol. 94 Advances in Chemical Physics. , 1-66 (1996).
  3. Fu, S. L., Lucy, C. A. Prediction of electrophoretic mobilities. 1. Monoamines. Anal. Chem. 70, 173-181 (1998).
  4. Harvey, D. . Modern Analytical Chemistry. , (2000).
  5. Oliver, J. D., Gaborieau, M., Hilder, E. F., Castignolles, P. Simple and robust determination of monosaccharides in plant fibers in complex mixtures by capillary electrophoresis and high performance liquid chromatography. J. Chromatogr. A. 1291, 179-186 (2013).
  6. Oliver, J. D., Sutton, A. T., Karu, N., Phillips, M., Markham, J., Peiris, P., Hilder, E. F., Castignolles, P. Simple and robust monitoring of ethanol fermentations by capillary electrophoresis. Biotechnology and Applied Biochemistry. 62, 329-342 (2015).
  7. Thevarajah, J. J., Sutton, A. T., Maniego, A. R., Whitty, E. G., Harrisson, S., Cottet, H., Castignolles, P., Gaborieau, M. Quantifying the Heterogeneity of Chemical Structures in Complex Charged Polymers through the Dispersity of Their Distributions of Electrophoretic Mobilities or of Compositions. Anal. Chem. 88, 1674-1681 (2016).
  8. Toutounji, M. R., Van Leeuwen, M. P., Oliver, J. D., Shrestha, A. K., Castignolles, P., Gaborieau, M. Quantification of sugars in breakfast cereals using capillary electrophoresis. Carbohydr. Res. 408, 134-141 (2015).
  9. Miramon, H., Cavelier, F., Martinez, J., Cottet, H. Highly Resolutive Separations of Hardly Soluble Synthetic Polypeptides by Capillary Electrophoresis. Anal. Chem. 82, 394-399 (2010).
  10. Mnatsakanyan, M., Thevarajah, J. J., Roi, R. S., Lauto, A., Gaborieau, M., Castignolles, P. Separation of chitosan by degree of acetylation using simple free solution capillary electrophoresis. Anal. Bioanal. Chem. 405, 6873-6877 (2013).
  11. Taylor, D. L., Ferris, C. J., Maniego, A. R., Castignolles, P., in het Panhuis, M., Gaborieau, M. Characterization of Gellan Gum by Capillary Electrophoresis. Australian Journal of Chemistry. 65, 1156-1164 (2012).
  12. Thevarajah, J. J., Gaborieau, M., Castignolles, P. Separation and characterization of synthetic polyelectrolytes and polysaccharides with capillary electrophoresis. Adv. Chem. 2014, 798503 (2014).
  13. Sutton, A. T., Read, E., Maniego, A. R., Thevarajah, J., Marty, J. -. D., Destarac, M., Gaborieau, M., Castignolles, P. Purity of double hydrophilic block copolymers revealed by capillary electrophoresis in the critical conditions. J. Chromatogr. A. 1372, 187-195 (2014).
  14. Righetti, P. G., Sebastiano, R., Citterio, A. Capillary electrophoresis and isoelectric focusing in peptide and protein analysis. Proteomics. 13, 325-340 (2013).
  15. Ali, I., Al-Othman, Z. A., Al-Warthan, A., Asnin, L., Chudinov, A. Advances in chiral separations of small peptides by capillary electrophoresis and chromatography. J. Sep. Sci. 37, 2447-2466 (2014).
  16. Kasicka, V. Recent developments in capillary and microchip electroseparations of peptides (2011-2013). Electrophoresis. 35, 69-95 (2014).
  17. Taylor, D. L., Thevarajah, J. J., Narayan, D. K., Murphy, P., Mangala, M. M., Lim, S., Wuhrer, R., Lefay, C., O’Connor, M. D., Gaborieau, M., Castignolles, P. Real-time monitoring of peptide grafting onto chitosan films using capillary electrophoresis. Anal. Bioanal. Chem. 407, 2543-2555 (2015).
  18. Rinaudo, M. Chitin and chitosan: Properties and applications. Prog. Polym. Sci. 31, 603-632 (2006).
  19. Li, Z., Leung, M., Hopper, R., Ellenbogen, R., Zhang, M. Feeder-free self-renewal of human embryonic stem cells in 3D porous natural polymer scaffolds. Biomaterials. 31, 404-412 (2010).
  20. Domard, A. A perspective on 30 years research on chitin and chitosan. Carbohydr. Polym. 84, 696-703 (2011).
  21. Shekaran, A., Garcia, A. J. Nanoscale engineering of extracellular matrix-mimetic bioadhesive surfaces and implants for tissue engineering. Biochim. Biophys. Acta Gen. Subj. 1810, 350-360 (2011).
  22. Custodio, C. A., Alves, C. M., Reis, R. L., Mano, J. F. Immobilization of fibronectin in chitosan substrates improves cell adhesion and proliferation. J. Tissue Eng. Regen. Med. 4, 316-323 (2010).
  23. Boateng, S. Y., Lateef, S. S., Mosley, W., Hartman, T. J., Hanley, L., Russell, B. RGD and YIGSR synthetic peptides facilitate cellular adhesion identical to that of laminin and fibronectin but alter the physiology of neonatal cardiac myocytes. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 288, C30-C38 (2005).
  24. Lefay, C., Guillaneuf, Y., Moreira, G., Thevarajah, J. J., Castignolles, P., Ziarelli, F., Bloch, E., Major, M., Charles, L., Gaborieau, M., Bertin, D., Gigmes, D. Heterogeneous modification of chitosan via nitroxide-mediated polymerization. Polym. Chem. 4, 322-328 (2013).
  25. Gartner, C., Lopez, B. L., Sierra, L., Graf, R., Spiess, H. W., Gaborieau, M. Interplay between Structure and Dynamics in Chitosan Films Investigated with Solid-State NMR, Dynamic Mechanical Analysis, and X-ray Diffraction. Biomacromolecules. 12, 1380-1386 (2011).
  26. Castignolles, P., Gaborieau, M., Hilder, E. F., Sprong, E., Ferguson, C. J., Gilbert, R. G. High resolution separation of oligo(acrylic acid) by capillary zone electrophoresis. Macromol. Rapid Commun. 27, 42-46 (2006).
  27. Chamieh, J., Martin, M., Cottet, H. Quantitative Analysis in Capillary Electrophoresis: Transformation of Raw Electropherograms into Continuous Distributions. Anal. Chem. 87, 1050-1057 (2015).
  28. Maniego, A. R., Ang, D., Guillaneuf, Y., Lefay, C., Gigmes, D., Aldrich-Wright, J. R., Gaborieau, M., Castignolles, P. Separation of poly(acrylic acid) salts according to topology using capillary electrophoresis in the critical conditions. Anal. Bioanal. Chem. 405, 9009-9020 (2013).
  29. Chung, T. W., Lu, Y. F., Wang, S. S., Lin, Y. S., Chu, S. H. Growth of human endothelial cells on photochemically grafted Gly-Arg-Gly-Asp (GRGD) chitosans. Biomaterials. 23, 4803-4809 (2002).
check_url/kr/54549?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Thevarajah, J. J., O’Connor, M. D., Castignolles, P., Gaborieau, M. Capillary Electrophoresis to Monitor Peptide Grafting onto Chitosan Films in Real Time. J. Vis. Exp. (116), e54549, doi:10.3791/54549 (2016).

View Video