Kapillarelektrophorese zum Monitor Peptid Verpflanzen auf Chitosanfilme in Echtzeit
Summary
Free solution capillary electrophoresis is a fast, cheap and robust analytical method that enables the quantitative monitoring of chemical reactions in real time. Its utility for rapid, convenient and precise analysis is demonstrated here through analysis of covalent peptide grafting onto chitosan films for improved cell adhesion.
Abstract
Free-Lösung Kapillarelektrophorese (CE) trennt Analyten, im allgemeinen geladenen Verbindungen in Lösung durch die Anwendung eines elektrischen Feldes. Im Vergleich zu anderen analytischen Trenntechniken, wie Chromatographie, ist CE billig, robust und erfordert effektiv keine Probenvorbereitung (für eine Reihe von komplexen natürlichen Matrices oder polymere Proben). CE ist schnell und kann verwendet werden , die Entwicklung der Mischungen in Echtzeit zu verfolgen (beispielsweise chemische Reaktionskinetik), da die Signale für die abgetrennten Verbindungen beobachtet direkt proportional zu ihrer Menge in Lösung.
Dabei wird die Effizienz der CE gezeigt, zur Überwachung der kovalente Pfropfung von Peptiden auf Chitosan-Filme für nachfolgende biomedizinische Anwendungen. Chitosan ist antimikrobiell und biokompatiblen Eigenschaften machen es zu einem attraktiven Material für biomedizinische Anwendungen wie Zellwachstumssubstrate. Kovalent Pfropfen der Peptid RGDS (Arginin – Glycin -Asparaginsäure – Serin) auf die Oberfläche des Chitosanfilme zielt auf die Zellanheftung zu verbessern. Historisch haben Chromatographie und Aminosäureanalyse wurde eine direkte Messung der Menge des aufgepfropften Peptid bereitzustellen, verwendet. Jedoch ermöglicht die schnelle Trennung und Abwesenheit von Probenvorbereitung durch CE vorgesehen gleichermaßen genaue noch eine Echtzeitüberwachung des Peptids Pfropfverfahren. CE ist in der Lage, die verschiedenen Komponenten der Reaktionsmischung abzutrennen und zu quantifizieren: Die (nicht gepfropften) -Peptid und die chemischen Kupplungsmittel. Auf diese Weise führt die Verwendung von CE in verbesserte Folien für Downstream-Anwendungen.
Die Chitosan-Filme wurden charakterisiert durch Festkörper-NMR (kernmagnetische Resonanz) -Spektroskopie. Diese Technik ist zeitraubend und kann nicht in Echtzeit angewendet werden, aber eine direkte Messung des Peptids ergibt und somit validiert die CE-Technik.
Introduction
Freie Lösung Kapillarelektrophorese (CE) ist eine Technik , die Verbindungen in Lösungen auf der Basis ihrer Ladung-zu-Reibungsverhältnis 1,2 trennt. Ladungs-Größenverhältnis wird häufig in der Literatur erwähnt, aber diese Vereinfachung gilt nicht für Polyelektrolyte, einschließlich Polypeptiden in dieser Arbeit, und wurde auch für kleine organische Moleküle 3 nicht als geeignet gezeigt. CE unterscheidet sich von anderen Trenntechniken in, daß es nicht eine stationäre Phase hat, nur eine Hintergrundelektrolyt (normalerweise ein Puffer). Dies ermöglicht die Technik in seiner Fähigkeit , robust zu sein , eine große Auswahl an Proben mit komplexen Matrices 4 wie Pflanzenfasern 5, Fermentation Sude 6 Pfropfen auf synthetischen Polymeren 7, Lebensmittelproben 8 und kaum lösliche Peptide 9 ohne langwierige Probenvorbereitung zur Analyse und Reinigung. Dies ist besonders bedeutsam für komplexe Polyelektrolyte, die Auflösung Probleme haben (such als Chitosan 10 und Gellangummi 11) und existieren daher als aggregierte oder in Lösung ausgefällt und haben ohne Probenfiltration erfolgreich analysiert. Ferner ging es um die Analyse von Zuckern in Frühstückszerealien Proben mit Partikeln von Frühstück Getreideproben in Wasser 8 gefällt injiziert wird . Diese erstreckt sich auch auf die Analyse von verzweigter Polyelektrolyte oder Copolymere 12,13. Umfangreiche Arbeit wurde auch in der Entwicklung von CE – Techniken speziell für die Analyse von Proteinen für die Proteomik 14, chirale Trennung von natürlichen oder synthetischen Peptide 15 und Mikrochip – Trennungen von Proteinen und Peptiden 16 abgeschlossen ist. Da die Trennung und Analyse in einer Kapillare nehmen, sind nur kleine Volumina von Probe und Lösungsmittel verwendet , das CE ermöglicht eine niedrigere Betriebskosten als andere Trennverfahren einschließlich Chromatographie 5,6,17 haben. Da die Trennung durch CE schnell ist, erlaubt es die monitoRing der Reaktionskinetik. Dies wurde in dem Fall der Pfropfung von Peptiden auf Chitosan – Filme für verbesserte Zelladhäsion 18 gezeigt.
Chitosan ist ein Polysaccharid aus der N -deacetylation von Chitin abgeleitet. Chitosan – Filme können solche für verschiedene biomedizinische Anwendungen verwendet werden , wie Bioadhäsive 19 und Zellwachstumssubstrate 18,20 aufgrund Chitosan der Biokompatibilität 21. Zellbindung an spezifische extrazelluläre Matrixproteine wie Fibronektin, Kollagenen und Laminin, direkt 22 , um das Überleben der Zellen verbunden. Bemerkenswert ist, erfordern unterschiedliche Zelltypen oft Bindung an verschiedene extrazelluläre Matrixproteine für das Überleben und die einwandfreie Funktion. Zellanheftung an Chitosan – Filme wurde durch das Pfropfen von Fibronektin 23 werden verstärkt dargestellt; jedoch Herstellung, Reinigung und Veredelung von solchen großen Proteinen ist nicht wirtschaftlich. Alternativ kann ein Bereich von kleinen Peptiden have wurde in der Lage gezeigt, die Eigenschaften der großen extrazellulären Matrixproteinen zu imitieren. Zum Beispiel Peptide wie die Fibronektin – Mimetika RGD (Arginin – Glycin – Asparaginsäure) und RGDS (Arginin – Glycin – Asparaginsäure – Serin) wurden die Zellbindung 24 verwendet zu erleichtern und zu erhöhen. Kovalentes Pfropfen von RGDS auf Chitosan – Filme zu einer verbesserten Zellanhaftung für Zellen in vivo 18 bis Fibronektin zu befestigen bekannt. Substituieren größere Proteine gefällt Fibronektin mit kleineren Peptiden, die die gleiche Funktionalität stellt eine erhebliche Kostenreduzierung aufweisen.
Hier Peptid an Chitosan Pfropfung wurde durchgeführt , wie zuvor 18 veröffentlicht. Wie zuvor gezeigt, bietet dieser Ansatz eine einfache und effiziente Pfropfen durch die Kupplungsmittel EDC-HCl (1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimid) und NHS (N – Hydroxysuccinimid) unter Verwendung der Carbonsäure der RGDS zu funktionalisieren zu sein auf das gepfropfteChitosan-Film. Zwei Vorteile dieses Pfropfverfahren sind , dass es keine Änderung des Chitosans benötigt oder des Peptids, und es wird in wäßrigem Medium durchgeführt zu maximieren Kompatibilität mit zukünftigen Zellkulturanwendungen 18,20. Als Kupplungsmittel und das Peptid aufladbar ist, ist CE ein geeignetes Verfahren für die Analyse der Reaktionskinetik. Wichtig ermöglicht, die Analyse der Reaktionskinetik mittels CE Echtzeit-Überwachung der Pfropfreaktion, und ermöglicht damit sowohl der Optimierung und der Pfropfgrad zu quantifizieren.
Während es nicht routinemäßig erforderlich ist, können die Ergebnisse der CE – Analyse durch eine direkte Messung des Peptids off-line überprüft werden Pfropfung auf die Chitosan – Filme unter Verwendung von Festkörper-NMR (kernmagnetische Resonanz) -Spektroskopie 25,26 , um die kovalente Pfropfung demonstrieren des Peptids auf den Film 18. Doch im Vergleich mit Festkörper-NMR-Spektroskopie, die Echtzeit-Analyse zur Verfügung gestellt vonCE ermöglicht die Quantifizierung des Peptids Verbrauch in Echtzeit und damit die Fähigkeit, die Kinetik der Reaktion zu bewerten.
Das oben erwähnte Verfahren ist einfach und ermöglicht die Echtzeit-Analyse von Peptid auf Chitosan-Filme mit indirekter Quantifizierung des Ausmaßes der Pfropfung Pfropfung. Die aufgezeigte Methode kann zur Echtzeit-quantitative Bewertung verschiedener chemischer Reaktionen verlängert werden, solange die Reaktanden oder die Produkte analysiert werden können berechnet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Einfachheit des hier beschriebene Protokoll macht es ideal für eine breite Anwendung geeignet. Allerdings muss besonderes Augenmerk auf die folgenden wesentlichen Schritte zu zahlen.
Proper CE Instrumentenaufbereitung
Es ist wichtig, einen bekannten Standard unmittelbar vor der Trennung von unbekannten Proben (wie auch am Ende einer Reihe von Trennungen) zu trennen, um die Gültigkeit der Kapillare und Instrument am Tag zu überprüfen. Dies…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MG, MO’C and PC thank the Molecular Medicine Research Group at WSU for Research Seed Funding, as well as Michele Mason (WSU), Richard Wuhrer (Advanced Materials Characterisation Facility, AMCF, WSU) and Hervé Cottet (Montpellier) for discussions.
Materials
| Water | Millipore | All water used in the experiment has to be of Milli-Q quality | |
| Chitosan powder (medium molecular weight) | Sigma-Aldrich | 448877 | lot MKBH1108V was used. Significant batch-to-batch variations occur with natural products such as polysaccharides |
| Acetic acid – Unilab | Ajax Finechem | 2-2.5L GL | laboratory reagent |
| Dimethylsulfoxide | Sigma-Aldrich | D4540 | laboratory reagent, slightly hazardous to skin, hazardous if ingested |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | laboratory reagent, corrosive |
| RGDS | Bachem | H‐1155 | peptide, bought from Auspep Pty Ltd |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide | Sigma-Aldrich | D80002 | Irritant to skin |
| N-hydroxysuccinimide | Sigma-Aldrich | 130672 | Irritant to skin |
| Sodium chloride | Ajax Finechem | 466-500G | laboratory reagent |
| Potassium chloride – Univar | Ajax Finechem | 384-500G | analytical reagent, slight skin irritant |
| Disodium hydrogen phosphate – Unilab | Ajax Finechem | 1234-500G | laboratory reagent, slight skin irritant |
| Potassium dihydrogen phosphate – Univar | Ajax Finechem | 4745-500G | analytical reagent, slight skin irritant |
| Oligoacrylate standard | custom made | See reference for synthetic protocol: Castignolles, P.; Gaborieau, M.; Hilder, E. F.; Sprong, E.; Ferguson, C. J.; Gilbert, R. G. Macromol. Rapid Commun. 2006, 27, 42-46 | |
| Boric acid | BDH AnalR, Merck Pty Ltd | 10058 | Corrosive |
| Hydrochloric acid – Unilab | Ajax Finechem | A1367-2.5L | laboratory reagent, corrosivie |
| Fused silica tubing | Polymicro (Molex) | TSP050375 | Flexible fused silica capillary tubing with standard polyimide coating, 50 µm internal diameter, 363 µm outer diameter |
| Agilent 7100 CE | Agilent Technologies | G7100CE | Capillary electrophoresis instrument |
| Orbital shaker | IKA | KS260 | |
| Electronic balance | Mettler Toledo | MS204S | |
| Milli-Q Synthesis | Millipore | ZMQS5VF01 | Ultrapure water filtration system |
| Parafilm | Labtek | PM966 | Parrafin wax |
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