La electroforesis capilar para supervisar Péptido injerto sobre quitosano películas en tiempo real
Summary
Free solution capillary electrophoresis is a fast, cheap and robust analytical method that enables the quantitative monitoring of chemical reactions in real time. Its utility for rapid, convenient and precise analysis is demonstrated here through analysis of covalent peptide grafting onto chitosan films for improved cell adhesion.
Abstract
electroforesis capilar-solución libre (CE) separa los analitos, compuestos generalmente practicados en solución a través de la aplicación de un campo eléctrico. En comparación con otras técnicas de separación analíticas, tales como cromatografía, CE es barato, robusto y eficaz no requiere la preparación de muestras (para una serie de matrices naturales complejos o muestras poliméricas). CE es rápido y se puede utilizar para seguir la evolución de las mezclas en tiempo real (por ejemplo, cinética de la reacción química), ya que las señales observadas para los compuestos separados son directamente proporcionales a su cantidad en solución.
Aquí, la eficiencia de la CE se demuestra para el seguimiento del injerto covalente de los péptidos en las películas de quitosano para aplicaciones biomédicas posteriores. propiedades antimicrobianas y biocompatibles de quitosano lo convierten en un material atractivo para aplicaciones biomédicas tales como sustratos para el crecimiento celular. Covalentemente injerto de los RGDS de péptidos (arginina – glicina -ácido aspártico – serina) sobre la superficie de películas de quitosan tiene por objeto mejorar la unión celular. Históricamente, cromatografía y análisis de aminoácidos han sido utilizados para proporcionar una medición directa de la cantidad de péptido injertado. Sin embargo, la separación rápida y la ausencia de preparación de la muestra proporcionada por CE permite el monitoreo en tiempo real igualmente precisa todavía de el proceso de injerto de péptidos. CE es capaz de separar y cuantificar los diferentes componentes de la mezcla de reacción: la (no injertado) péptido y los agentes de acoplamiento químico. De esta manera el uso de CE resulta en películas mejoradas para aplicaciones de aguas abajo.
Las películas de quitosano se caracterizaron mediante espectroscopía de RMN de estado sólido (resonancia magnética nuclear). Esta técnica es más tiempo y no se puede aplicar en tiempo real, pero da una medición directa del péptido y por lo tanto valida la técnica de la CE.
Introduction
Electroforesis capilar solución libre (CE) es una técnica que separa compuestos en soluciones basadas en su relación de 1,2-carga a la fricción. Relación de carga de tamaño se menciona a menudo en la literatura, pero esta simplificación no se aplica a los polielectrolitos, incluyendo polipéptidos en este trabajo, y también se demuestra que no es apropiado para pequeñas moléculas orgánicas 3. CE se diferencia de otras técnicas de separación en que no tiene una fase estacionaria, solamente un electrolito de fondo (generalmente un tampón). Esto permite que la técnica sea robusto en su capacidad para analizar una amplia gama de muestras con matrices complejas 4 tales como fibras vegetales 5, cervezas de fermentación de 6 injerto sobre polímeros sintéticos 7, muestras de alimentos 8, y péptidos difícilmente solubles 9 sin preparación de la muestra tedioso y purificación. Esto es especialmente significativo para polielectrolitos complejos que tienen problemas de disolución (sUCH como quitosano 10 y gellan goma 11) y por lo tanto existe como agregado o precipitado en la solución y se han analizado con éxito sin la filtración de la muestra. Además, el análisis de azúcares en los cereales para el desayuno implicado la inyección de muestras con partículas de muestras de cereales para el desayuno precipitado en agua 8. Esto también se extiende al análisis de polielectrolitos o copolímeros 12,13 ramificados. Mucho trabajo también se ha completado en el desarrollo de técnicas de CE específicamente para el análisis de proteínas para la proteómica 14, la separación quiral de los péptidos naturales o sintéticos 15 y separaciones de microchips de proteínas y péptidos 16. Dado que la separación y análisis se llevan a cabo en un capilar, solamente pequeños volúmenes de muestra y los disolventes se utilizan que permite CE tener un coste de funcionamiento inferior a otras técnicas de separación incluyendo cromatografía 5,6,17. Dado que la separación por CE es rápido, permite que el monitoanillo de la cinética de reacción. Esto se demostró en el caso de los injertos de los péptidos en las películas de quitosano para mejorar la adhesión de las células 18.
El quitosano es un polisacárido derivado de la -deacetylation N de la quitina. Películas de quitosan se pueden utilizar para diversas aplicaciones biomédicas tales como bioadhesivos 19 y sustratos de crecimiento celular 18,20, debido a la biocompatibilidad de quitosano 21. La unión celular a las proteínas de la matriz extracelular específicas, tales como fibronectina, colágenos y laminina, está directamente relacionada con la supervivencia de las células 22. Notablemente, diferentes tipos de células a menudo requieren fijación a diferentes proteínas de la matriz extracelular para la supervivencia y la función apropiada. La unión celular a las películas de quitosano ha demostrado ser mejorado mediante el injerto de fibronectina 23; Sin embargo, la preparación, la purificación y el injerto de tales proteínas grandes no es económicamente viable. Alternativamente una serie de pequeños péptidos VHAe ha demostrado que es capaz de imitar las propiedades de las grandes proteínas de la matriz extracelular. Por ejemplo, los péptidos tales como los RGD miméticos fibronectina (arginina – glicina – ácido aspártico) y RGDS (arginina – glicina – ácido aspártico – serina) se han utilizado para facilitar y aumentar la unión celular 24. Covalente injerto de MFG sobre pelıculas de quitosano dio lugar a la unión celular mejorada para las células conocidas para unir a la fibronectina in vivo 18. La sustitución de proteínas más grandes le gusta la fibronectina con péptidos más pequeños que tienen la misma funcionalidad proporciona una importante reducción de costes.
Aquí, se realizó péptido injerto de quitosano como publicado previamente 18. Como se ha demostrado anteriormente, este enfoque proporciona injerto simple y eficiente mediante el uso de los agentes de acoplamiento EDC-HCl (1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida) y NHS (N -hidroxisuccinimida) para funcionalizar el ácido carboxílico de los RGDS ser injertado en lapelícula de quitosano. Dos ventajas de este método de injerto son que no requiere ninguna modificación del quitosano o del péptido, y se llevaron a cabo en medio acuoso para maximizar la compatibilidad con futuras aplicaciones de cultivo celular 18,20. Como los agentes de acoplamiento y el péptido pueden ser cargadas, CE es un método adecuado para el análisis de la cinética de reacción. Es importante destacar que, el análisis de la cinética de reacción a través de CE permite la supervisión en tiempo real de la reacción de injerto, y por lo tanto permite tanto la optimización y cuantificar el grado de injerto.
Si bien no es habitualmente necesario, los resultados del análisis CE se pueden validar fuera de línea por una medición directa del péptido injerto sobre las películas de quitosan mediante RMN en estado sólido (resonancia magnética nuclear) espectroscopia de 25,26 para demostrar el injerto covalente del péptido sobre la película 18. Sin embargo, en comparación con la espectroscopía de RMN en estado sólido, el análisis en tiempo real proporcionada porCE permite la cuantificación de la consumo de péptido en tiempo real y por lo tanto la capacidad de evaluar la cinética de la reacción.
El método mencionado anteriormente es simple y permite el análisis en tiempo real de péptido injerto sobre películas de quitosan con cuantificación indirecta de la extensión de la de injerto. El método demostrado se puede extender a la evaluación cuantitativa en tiempo real de las diferentes reacciones químicas, siempre que los reactivos o los productos a ser analizados se puede cargar.
Protocol
Representative Results
Discussion
La simplicidad del protocolo descrito aquí lo hace ideal para una amplia aplicación. Sin embargo, especial atención debe prestarse a los siguientes pasos clave.
La preparación del instrumento adecuado CE
Es importante separar un estándar conocido inmediatamente antes de la separación de muestras desconocidas (así como al final de una serie de separaciones) para comprobar la validez del capilar y el instrumento en el día. Esta norma puede …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MG, MO’C and PC thank the Molecular Medicine Research Group at WSU for Research Seed Funding, as well as Michele Mason (WSU), Richard Wuhrer (Advanced Materials Characterisation Facility, AMCF, WSU) and Hervé Cottet (Montpellier) for discussions.
Materials
| Water | Millipore | All water used in the experiment has to be of Milli-Q quality | |
| Chitosan powder (medium molecular weight) | Sigma-Aldrich | 448877 | lot MKBH1108V was used. Significant batch-to-batch variations occur with natural products such as polysaccharides |
| Acetic acid – Unilab | Ajax Finechem | 2-2.5L GL | laboratory reagent |
| Dimethylsulfoxide | Sigma-Aldrich | D4540 | laboratory reagent, slightly hazardous to skin, hazardous if ingested |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | laboratory reagent, corrosive |
| RGDS | Bachem | H‐1155 | peptide, bought from Auspep Pty Ltd |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide | Sigma-Aldrich | D80002 | Irritant to skin |
| N-hydroxysuccinimide | Sigma-Aldrich | 130672 | Irritant to skin |
| Sodium chloride | Ajax Finechem | 466-500G | laboratory reagent |
| Potassium chloride – Univar | Ajax Finechem | 384-500G | analytical reagent, slight skin irritant |
| Disodium hydrogen phosphate – Unilab | Ajax Finechem | 1234-500G | laboratory reagent, slight skin irritant |
| Potassium dihydrogen phosphate – Univar | Ajax Finechem | 4745-500G | analytical reagent, slight skin irritant |
| Oligoacrylate standard | custom made | See reference for synthetic protocol: Castignolles, P.; Gaborieau, M.; Hilder, E. F.; Sprong, E.; Ferguson, C. J.; Gilbert, R. G. Macromol. Rapid Commun. 2006, 27, 42-46 | |
| Boric acid | BDH AnalR, Merck Pty Ltd | 10058 | Corrosive |
| Hydrochloric acid – Unilab | Ajax Finechem | A1367-2.5L | laboratory reagent, corrosivie |
| Fused silica tubing | Polymicro (Molex) | TSP050375 | Flexible fused silica capillary tubing with standard polyimide coating, 50 µm internal diameter, 363 µm outer diameter |
| Agilent 7100 CE | Agilent Technologies | G7100CE | Capillary electrophoresis instrument |
| Orbital shaker | IKA | KS260 | |
| Electronic balance | Mettler Toledo | MS204S | |
| Milli-Q Synthesis | Millipore | ZMQS5VF01 | Ultrapure water filtration system |
| Parafilm | Labtek | PM966 | Parrafin wax |
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