エレクトロポレーションによる齧歯類坐骨神経内のシュワン細胞へのインビボ遺伝子導入で

Summary

Here, we present an in vivo technique for gene transfer to Schwann cells (SCs) in the rodent sciatic nerve. This simple technique is useful for investigating signaling mechanisms involved in the development and maintenance of myelinating SCs.

Abstract

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous system. SC-selective genetic manipulation in living animals is a powerful technique for studying the molecular and cellular mechanisms of SC myelination and demyelination in vivo. While knockout/knockin and transgenic mice are powerful tools for studying SC biology, these methods are costly and time consuming. Viral vector-mediated transgene introduction into the sciatic nerve is a simpler and less laborious method. However, viral methods have limitations, such as toxicity, transgene size constraints, and infectivity restricted to certain developmental stages. Here, we describe a new method that allows selective transfection of myelinating SCs in the rodent sciatic nerve using electroporation. By applying electric pulses to the sciatic nerve at the site of plasmid DNA injection, genes of interest can be easily silenced or overexpressed in SCs in both neonatal and more mature animals. Furthermore, this in vivo electroporation method allows for highly efficient simultaneous expression of multiple transgenes. Our novel technique should enable researchers to efficiently manipulate SC gene expression, and facilitate studies on SC development and function.

Introduction

The rapid transmission of sensory and motor information in the peripheral nervous system is permitted by the myelin sheath, which is formed by myelinating Schwann cells (SCs)¹. Insulation of axons by the myelin sheath enables saltatory conduction, which increases the speed of nerve impulses. In disorders in which the development or maintenance of the myelin sheath is impaired, nerve conduction speed is reduced. This results in neuropathy involving motor and sensory dysfunction. Although there are many studies on the molecular mechanisms of myelination and demyelination in the peripheral nervous system, the roles of the numerous proteins involved in these processes remain unclear.

To study the molecular mechanisms of SC myelination/demyelination in vivo, genetic approaches have been used to modify gene expression in animals. A powerful approach is the use of knockout/knockin or transgenic animals. However, the generation of these animals is expensive and time consuming. For SC-specific gene manipulation, crossing floxed strains with Cre mice or other conditional gene expression methods are necessary. This again is laborious and time intensive. In recent years, a cutting-edge genetic technology, the CRISPR-Cas9 system, has made the generation of genetically modified mice much quicker (about 4 weeks)^2,3, but this method is hindered by target sequence limitations, and suffers from off-target effects. As an alternative method, viral vector-mediated gene transfer is a faster and easier method of achieving gene transfer into SCs in vivo^4-6. Indeed, the generation of viral vectors is less expensive, and takes a shorter time (within a few weeks), and gene manipulation of SCs can be achieved by simply injecting engineered viral vectors, such as adenoviral vectors, adeno-associated viral (AAV) vectors, and lentiviral vectors, into the sciatic nerve. Because these viral vectors have different characteristics, users have to choose the one best suited for their purpose. Adenoviral vectors infect axons and SCs in both young and mature sciatic nerves. In particular, adenoviral vectors have higher selectively for non-myelinating SCs than myelinating SCs. Adenoviruses can cause immune responses, and accordingly, immunodeficient strains should be used⁵. AAV vectors are currently the most widely used viral vectors, and allow in vivo gene transfer with lower toxicity⁷. AAV can transduce both axons and SCs by direct injection into the nerve fibers^8,9. However, AAV-mediated protein expression usually requires 3 weeks or longer to reach maximum levels^7,9. Therefore, it is difficult to analyze myelination, which actively progresses during the two week postnatal period. Lentiviral vectors have higher selectively for myelinating SCs than non-myelinating SCs, and do not have toxic effects on sciatic nerves. However, lentiviral vectors do not infect SCs in more mature nerves⁵, and therefore are unsuitable for analyzing events such as the demyelination process.

Electroporation is another faster and easier approach to achieve in vivo gene transfer. It has been reported that in vivo transfection of SCs can be achieved when electroporation is applied to transected rat sciatic nerves¹⁰. However, because this method requires nerve transection for gene delivery, the application is limited to the analysis of the damaged nerves. Here, we describe an alternative method that allows the delivery of transgenes into myelinating SCs in intact rat sciatic nerves using electroporation¹¹. This method requires plasmid construction, which can usually be completed within a week. Then, by simply delivering electric pulses to the site on the sciatic nerve where the plasmid DNA was injected, highly selective transfection of myelinating SCs can be achieved in neonatal as well as in more mature animals. By electroporating multiple plasmids, simultaneous expression of a variety of genes can be easily achieved. The ability to simultaneous express multiple molecules, such as signaling proteins, short-hairpin RNAs (shRNAs) and functional probes, is crucial for investigating complex processes such as myelination and demyelination. The novel in vivo electroporation method described in this paper will be a powerful tool, allowing researchers to analyze the function of a multitude of molecules and their interactions in myelinating SCs.

Protocol

研究のためのラットの使用は、東京大学の動物福祉委員会によって確立されたガイドラインに従いました。 プラスミドDNAの1.Preparation 哺乳動物細胞12発現プラスミド中のcDNAまたはshRNA配列をサブクローニングすることによってin vivoでエレクトロポレーションのためのDNAプラスミドを生成します。それは強く、安定した発現を可能にするため、サイトメガロウイルス最初期エンハンサーおよびニワトリβアクチンプロモーターの融合（CAG）プロモーター駆動プラスミド13を使用してください。 CAGプロモーターの制御下でshRNAの発現のために、shRNAの14をサブクローニングのためにmir30ベースのshRNAカセットシステムを使用しています。 製造元の指示に従ってマキシプレップキットを用いてプラスミドDNAを精製し、HEPES緩衝生理食塩水（140mMの塩化ナトリウム、0.75ミリモルのNa 2 HPO 4、25mMのHEPES、pHは7.40）でDNAを再懸濁します。 μgの/μLを≥4するDNAの濃度を調整します。 <li> 4μgの/μlの濃度にプラスミドDNA溶液を用意し、注射部位を標識するために、高速グリーン染料の最小量（0.01％の最終濃度）を追加します。複数のプラスミドの同時エレクトロポレーションが必要な場合、4μgの/μlのプラスミドDNA溶液の総濃度を調整します。 注：プラスミドDNAの最適組成は、各プラスミドのトランスフェクション効率に応じて決定されるべきです。 手術器具および生理食塩水の2滅菌オートクレーブ手術器具および0.9％NaCl溶液。 ガラスマイクロピペットの調製ピペットプラーを用いてガラスピペットを引き出します。 30-50ミクロンの直径にピペットの先端をカットします。以下のパラメータを使用します。熱、600;ベロシティ、50;時間、75。 4.動物の手術、DNA注射とエレクトロポレーション注：オーバーこの手順の図は、 図1に記載されている。仔ラットの手順は、ここに記載されているが、この方法は、同様の手順を使用して、より成熟した動物にも適用可能です。 動物は4％（体積/体積）に0.4リットル/分およびイソフルラン濃度に酸素流量を調整することで不動になるまで、インダクションボックス内のイソフルランでラットを麻酔。適切な麻酔を確認するためにピンチつま先を実行します。 双眼顕微鏡下で予熱した暖かいにラットを入れ、かつ連続的にフェイスマスクを介してイソフルランを投与することにより麻酔を維持します。 0.2リットル/分および2％（体積/体積）にイソフルラン濃度に酸素流量を調整します。目は動物の目が開いている場合は、目の乾燥を防ぐために廃棄し使用します。 外科手術用テープで足を固定してください。 ポビドンヨードと後部大腿部の皮膚をきれいにし、メスで切開を行います。 注：外科的領域が時間で覆われている場合は、外科的領域を剃ります空気。 大腿四頭筋の間に開口部を作成することによって、坐骨神経を露出すると、筋肉や上腕二​​頭筋が縫い針で筋肉大腿大腿。 0.9％NaCl溶液で神経を濡らします。リントフリーペーパーで余分な水分を吸収します。 フレキシブルチューブの上にガラスマイクロピペットの基部を挿入して、静かに吸引することにより、マイクロピペットにDNA溶液（少なくとも1マイクロリットル）の適切な量を記入してください。 そっと針を用いて神経の先端側を引っ張ることで露出した神経を持ち上げます。 注意：機械的ストレスを最小限にするために神経に緊張を与えないでください。 神経の遠位部位にガラスマイクロピペットを挿入し、（フレキシブルチューブの開放端部に吹き付けることによって）圧力を適用することによって、DNA溶液を注入します。神経が緑（1μlの最大値）が表示されるまでDNA溶液を注入します。マイクロピペットの頻繁な挿入が神経を損傷することがあるので、倍以上のマイクロピペットを挿入しないでください。 TWEを配置離れて神経1〜2ミリメートル程度エゼル型白金電極。電極と0.9％NaCl溶液で神経の間のギャップを埋めます。 注：神経への機械的ストレスを避けるために、電極と神経を持たないでください。 電極とエレクトロを使用して、注射部位に電気パルスを適用します。最初のパルスセットした後、電極を反転し、別のパルスのセットを適用します。以下のパラメータを使用します。電圧、50 Vを、パルス持続時間、5ミリ秒。パルス間隔、100ミリ秒。パルス数、4回。 0.9％NaCl溶液でエレクトロポレーションサイトを清掃してください。 繰り返して、反対側の坐骨神経に4.4から4.11繰り返します。 5.ポスト​​エレクトロポレーションシアノアクリレート接着剤で切開を閉じます。 接着剤を乾燥させた後、ポビドンヨードで傷口をきれいに。 フェイスマスクから子犬を解放します。それは完全に麻酔から回復できるようにするために、時間の少なくともウォーマーに子犬を温めます。 Dそれは十分な意識を取り戻したまでO子犬を無人のままにしません。 麻酔から回復した後、母ラットに子犬を返します。完全に回復するまでの子犬を返さないでください。 6.手術後実験11を行うまで、ケージの住宅仔ラット（ 図3の例を参照してください）。カルプロフェン投与（5 mgの/ kgで、腹腔内）、非ステロイド性抗炎症薬、またはブプレノルフィン（0.1ミリグラム/ kg、皮下）、オピオイド鎮痛薬、必要に応じて。 注：ラットの子犬が十分に成長しないか、炎症が手術部位付近に観測されている場合は、実験から動物を除外します。

Representative Results

プラスミド発現性赤色蛍光タンパク質（RFP）でトランスフェクトした坐骨神経の例は、図2Aに示されています。双極性形態を示す細胞は、SCの特徴は、まばらにRFPをトランスフェクトしました。いいえRFPの蛍光は軸索で検出されませんでした。我々は通常〜すべての神経で100トランスフェクトのSCを見つけます。このトランスフェクション効率は、レンチウイルスベクター4を用いたin vivo SC感染効率に似ているようです。 免疫染色実験は、ほとんど（〜96％）P7のS100、SCマーカー（ 図2B）のための共同標識し、P14のでRFP陽性細胞の91％MBPのための共同標識、髄鞘形成のSCマーカーでRFP陽性細胞（ 図2C）、エレクトロポレーションによる遺伝子導入は、SCのを髄鞘形成するための高度に選択的であることを示唆しています。 SCへの複数の遺伝子の導入<ein vivoでのmは>髄鞘形成/脱髄のメカニズムを調査するために非常に有用であろう。ここに記載のin vivoエレクトロポレーション法の主な利点は、簡単な手順で複数の遺伝子を導入するための能力です。図2Dは​​、in vivoエレクトロポレーションに使用して、GFPおよびRFPを発現するプラスミドの混合物を用いてトランスフェクト坐骨神経の代表画像を示しています。 SCの約97％は、複数の遺伝子の非常に効率的な送達は、単に複数のプラスミドの混合物をエレクトロポレーションによって達成することができることを示唆し、二重陽性GFPおよびRFPました。 げっ歯類では、ミエリン形成が劇的生後最初の2週間の間に増加し、出産の周りに開始し、その後徐々に減少します。このように、遺伝的にこれらの発達の時間窓の間のSCを操作することによって、髄鞘形成のこれらの異なる段階のメカニズムを明確にすることができます。レンチウイルスベクターはのための良いツールです彼らは最小の毒性を持っている、特にとして、髄鞘形成をnalyzingが、レンチウイルスは唯一の新生児の坐骨神経の5,6に感染します 。トランスフェクションは（ 図2E、下）P3（ 図2E、上）またはP14に実施された場合と比較して、エレクトロポレーション媒介遺伝子導入はうまく動作します。 生体内エレクトロポレーション法における新規のアプリケーションがここで説明されている。 図3Aは、GFPを発現する種々の発生段階（P7、P14、P21とP31）で、ミエリン形成のSCの光学顕微鏡像を示します。光学顕微鏡分析により、そのような長さと直径との形態学的パラメータの変化を評価することができます。これらのパラメータは、エレクトロポ神経が重大な損傷を及ぼすことなく開発することを示唆し、無傷のラット末梢神経15,16と比較して同様の値を持っていることに注意してください。 図3Bは、LacZをexpreの電子顕微鏡像を示しますミエリン化のSCをssing。この場合には、LacZの発現をマーカーとして使用しました。 bluo-galを、エタノール不溶性基質を用いて、βガラクトシダーゼ染色、電子顕微鏡11,17によりトランスフェクトされたSCのミエリン構造の解析を可能にします。これらの実験では、シグナル伝達分子の役割は、それによって、機能喪失または機能獲得型の影響の分析を可能にする、それらの発現をサイレンシングするか、増強することによって調べることができます。固定組織の分析に加えて、 インビボでのエレクトロポレーション媒介遺伝子移入はまた、イメージング実験をライブに適用することができます。例えば、 図3Cは、G-GECO1.1 18、緑色蛍光細胞質ゾルのCa 2+インジケーター、およびR-GECO1mt 19、赤色蛍光ミトコンドリアのCa 2+指示薬を共発現ミエリンSCを示しています。これらの指標を発現することによって、我々はのSCのミエリン形成にサイトゾルおよびミトコンドリアのCa 2+濃度を制御するシグナル伝達経路を同定し 。したがって、本発明の方法は、遺伝的にコードされた蛍光プローブは、関心のある信号を検出するために利用可能である場合は特に、シグナル伝達機構の種々の研究に使用することができます。 図 1：I Nインビボ 電気穿孔方法 の概略まず、麻酔したラットの坐骨神経を露出させます。第二に、プラスミドDNAは、坐骨神経に注入されます。第三に、電気パルスは、鉗子状の電極を介して注入部位に送達されます。最後に、傷は接着剤で閉じられています。この手順では、反対側の神経に繰り返すことができる。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 "> 図2： トランスフェクトされた坐骨神経上の代表的な結果 （A）トランスフェクトされた坐骨神経の代表画像。神経はP3でRFPを発現するプラスミドでトランスフェクトし、P7に固定しました。 （B）S100、SCマーカーとの共局在化を示すP7でのRFP-トランスフェクトされた細胞の代表画像。 MBP、髄鞘形成のSCマーカーと共局在化を示すP14でRFPトランスフェクト坐骨神経の（C）A代表画像。 （D）GFPおよびRFPを発現するプラスミドで同時トランスフェクション坐骨神経の代表画像。トランスフェクトされたSCが同時にGFPおよびRFPを発現しました。 （E）ミエリン形成が始まるP3、（上）でトランスフェクトP31でのSCをミエリン形成の画像、および最も大きな軸索 ​​は（下）有髄なっP14、でトランスフェクトP31におけるミエリン形成のSCの画像、そのTRANSFを示唆しています髄鞘形成のSCのectionは、新生児の神経ではなく、より成熟した神経だけでなく達成することができます。スケールバー=200μmの（A）。 50ミクロン（BE）。この数値は、当社の以前の出版物11から変更されました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 図 3：in vivoでの エレクトロポレーション （A） のアプリケーションのSCをミエリン形成の発展の光顕微鏡分析。坐骨神経はP3でのGFP発現プラスミドをエレクトロポレーションした、と様々な発達段階（P7、P14、P21とP31）で固定しました。 GFP陽性SCの代表的な画像は、左側に示されています。平均長さと直径は、（n = 3の平均±SEMとしてまとめられています右側の3神経）47から0。開発が進むにつれてのSCが増加するミエリン形成の長さと直径。 （B）をコードするプラスミドのLacZでトランスフェクトされた坐骨神経の電子顕微鏡像。 （左白アスタリ​​スク）トランスフェクトされたSCが細かくβガラクトシダーゼ反応生成物の析出物で標識しました。 （C）G-GECO1.1、緑色蛍光細胞質ゾルのCa 2+インジケーター、およびR-GECO1mt、赤色蛍光ミトコンドリアのCa 2+指示薬で同時トランスフェクションSCの画像。白い点線の長方形内の領域は、右側のパネルに拡大して示されています。スケールバー=50μmの（AおよびC） 1ミクロン（B）。この数値は、当社の以前の出版物11から変更されました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

Discussion

In this paper, we describe a simple and efficient method that allows in vivo gene transfer to myelinating SCs in the rat sciatic nerve using electroporation. This method allows highly selective gene expression in myelinating SCs by simply applying electric pulses to the plasmid DNA-injected sciatic nerve. Because the molecular mechanisms of myelination and demyelination in the peripheral nervous system remain unclear, the present in vivo electroporation method will be a powerful tool to clarify the roles of multiple genes of interest in living animals.

A critical requirement of this method is to keep damage to the nerve during surgery to a minimal level. Should surgical damage cause excessive inflammation, the sciatic nerve may degenerate. To avoid this, one must conduct surgery with extreme care, so as to not damage the blood vessels around the nerve. Mechanical stress to the nerve during the surgery can also be a cause of nerve damage. To minimize mechanical stress, lifting the exposed nerve should be done as gently as possible, and the tweezer-type electrode should be placed close to the nerve without contact. Furthermore, electrical pulses that are too strong can cause undesirable large leg movement, which leads to mechanical stress, or can burn the nerve. If significant damages are observed in the nerves, we recommend reducing the electrical pulse intensities or placing the electrode further away from the nerve.

In our present protocol, CAG promoter-driven plasmids were used as expression vectors. CAG promoter-driven plasmids allow high levels of gene expression in myelinating SCs in vivo. We also have tried a CMV promoter, another widely used universal promoter for mammalian gene expression, but expression of the gene product was very weak. This is consistent with previous results, in which electroporation-mediated transfection was conducted in the embryonic brain²⁰. Therefore, we recommend using CAG promoter-driven plasmids for the in vivo electroporation method.

Because axonal signaling is a key factor in myelination/demyelination²¹, gene modification in neurons is also important. However, delivery of transgenes using our in vivo electroporation method is limited to SCs. It has been reported that gene delivery into sciatic nerve axons can be achieved when in vivo electroporation is applied to dorsal root ganglion (DRG) neurons in adult rats²². This suggests that delivery of plasmid DNA to the cell body is likely to be critical for in vivo transfection of peripheral axons. Thus, to examine the involvement of axonal molecules in myelination/demyelination, researchers should use neuron-specific genetic methods such as genetically modified animals, neuron-specific viral vectors, or in vivo electroporation to DRG neurons.

Compared with current methods, such as the generation of genetically modified animal lines²³ and delivery of transgenes by viral vectors^4-6, gene modification of SCs by in vivo electroporation is simpler. This method only requires several days for plasmid DNA construction and one day for electroporation surgery. Plasmid DNA construction does not require a biohazard room that is usually essential for viral vector handling. In addition, one of the advantages of the electroporation method is the capacity for simultaneous expression of multiple gene products using a simple protocol. Our novel technique will be useful for analyzing the interaction of a variety of signaling molecules involved in myelination and demyelination. In particular, by permitting the cotransfection of a number of different intracellular fluorescent probes, our method should be a powerful tool for investigating intracellular signaling dynamics in SCs using live imaging experiments.

Materials

Genopure Plasmid Maxi Kit	Roche	03 143 422 001	Plasmid DNA purification kit
Fast Green CFC	WAKO	069-00032	Dye for DNA injection
GC 150T-10	HARVARD APPARATUS	30-0062	Glass capillary
Suction tubing	Drummond	05-2000-00	Suction tubing for micro injection
MODEL P-97	SUTTER INSTRUMENT CO.		Micropipette puller
CUY21 Single Cell	BEX	Electroporator CUY21 Single Cell	Pulse generator
Electric warmer	KODEN	CAH-6A	Warmer during the surgery
Isofluolane	Mylan	1119701G1076	Anesthetic