Method Article

HIV-1 감염 라이브 차 인간 대 식세포에서 측정 Phagosome 마이그레이션 및 속도

DOI:

10.3791/54568

⸱

September 5th, 2016

 ,  ,  , 
1Inserm U1016, Institut Cochin, CNRS UMR 8104, Université Paris Descartes, Sorbonne Paris Cité

In This Article

Summary

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우리는 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 1형에 감염되거나 감염되지 않은 살아있는 세포에서 세포 중심을 향해 이동하는 식체체의 속도를 측정하는 방법을 설명하며, 회전 디스크 컨포칼 형광 현미경을 사용하여 형광 감염 세포를 식별하고 명시야 현미경을 사용하여 식체를 검출합니다.

Abstract

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대식세포는 선천면역과 특이면역 사이의 교차로에서 중요한 역할을 하는 식세포세포입니다. 이들은 인간 면역결핍 바이러스(HIV)-1에 감염될 수 있으며, 세포병성 영향에 대한 내성 때문에 지속적인 바이러스 저장소로 간주될 수 있습니다. 또한 HIV에 감염된 대식세포는 기회감염성 질환의 발병에 기여하는 결함 있는 기능을 보인다.

HIV-1이 대식세포의 식세포 반응을 손상시키는 정확한 메커니즘은 알려져 있지 않습니다. 우리는 이전에 대식세포가 HIV-1에 감염되었을 때 다양한 미립자 물질의 흡수가 억제된다는 것을 보여주었습니다. 이 억제는 부분적일 뿐이었고 HIV에 감염된 대식세포 내에서 식체가 형성되었습니다. 따라서 우리는 이러한 식체의 운명을 분석하는 데 집중했습니다. 식생체 성숙은 이러한 구획이 세포 중심을 향한 이동을 동반하며, 여기서 리소좀과 융합하여 섭취된 물질의 분해를 담당하는 식작용소체를 생성합니다. 우리는 IgG-opsonized Sheep Red Blood Cells를 식세포작용의 표적으로 사용했습니다. 개별 HIV에 감염된 대식세포에서 식체의 구심 이동 속도를 측정하기 위해 명시야와 형광 컨포칼 현미경을 조합하여 사용했습니다. 우리는 핵을 향한 식체의 거리를 계산한 다음 식체의 속도를 계산하는 방법을 확립했습니다. HIV 감염된 세포는 GFP 표현 바이러스 덕분에 확인되었지만, 이 방법은 감염되지 않은 세포 또는 모든 유형의 감염 또는 치료에 적용할 수 있습니다.

Introduction

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대식세포는 선천면역계와 항상성에 중요한 역할을 합니다. 이들은 식세포작용(phagocytosis) 1,2라는 과정을 통해 병원균과 파편을 내부화하고 제거하는 전문적인 식세포입니다. 미립자 물질이 삼켜진 후 형성되는 닫힌 구획인 phagosome은 내세포 구획과 함께 일련의 융합 및 분열 사건을 겪어 phagolysosome이라고 하는 분해 구획으로 이어집니다. 이 구획은 양성자 펌핑 v-ATPase의 획득으로 인해 산성 pH를 가지며 가수분해 효소를 포함하며 리소좀 관련 막 단백질(LAMP)이 풍부합니다. 식체(phagosome)의 성숙은 미세소관 3,4를 통해 세포 중심을 향하여 리소좀(lysosome)이 축적되는 핵주위 위치에 도달하는 이동을 동반합니다.

많은 병원체가 식체체 성숙을 가로채는 것으로 보고되었으며, 여기에는 자신이 서식하는 액포 환경을 변형시키는 세포 내 생활 방식을 가진 박테리아가 포함됩니다 5. 인체 면역결핍 바이러스(HIV)-1은 T 세포 외에도 대식세포를 표적으로 합니다. 대식세포는 T 세포와 달리 바이러스의 세포병성 영향에 내성이 있기 때문에 바이러스의 저장소로 간주될 수 있습니다. 또한 HIV-1에 감염된 대식세포는 식세포 기능에 결함이 있어 기회감염성 질....

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Protocol

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이 프로토콜은 국내 및 국제 법규 및 지역 규정에 엄격한에 따라 수행되어야한다. 연구 목적으로 혈액을 기증 동의를 준 건강한 기증자로부터 혈액이 기관이 계약을 체결 한있는 수혈 센터에서 얻을 수있다. 인간의 혈액을 사용하는 경우 특별 보호는주의해야합니다. HIV-1과 실험은 3 또는 2 (BSL-3 또는 2) 연구소는 현지 법률에 따라 바이오 안전성 수준에서 수행해야합니다.

접착에 의한 밀도 구배 원심 분리 및 선택에 의해 인간 단핵구 유래 대 식세포 (hMDMs) 1. 준비

  1. 건강한 기증자 (9 ㎖)에서 신선한 혈액으로 시작합니다. 70 ml의 최종 용적을 수득 칼슘 및 마그네슘 2+없이 멸균 1X 인산 완충 생리 식염수 (PBS)와 신선한 혈액의 전체 부피를 희석하고 부드럽게 개의 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 희석 된 혈액을 추가 (튜브 당 35 mL) 중 , 15 ml의 상단에eutral가 높은 각 튜브 이미 용액에 높은 질량 친수성 ​​다당류 지형.
  2. 브레이크없이 20 ° C에서 20 분 동안 537 XG에 혈액을 원심 분리기는 모두 튜브. 그런 계면 흐린 셀 링에 포함 된 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 수집하고 칼슘 및 마그네슘 ....

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Results

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HIV-1 감염과 감염되지 않은 hMDMs 의해 식세포 작용의 FcR 매개 초상권 타겟으로의 IgG - 옵 소닌 SRBCs (도 1)를 사용하여 여기에서 설명된다. 이 프로토콜의 중요한 단계는 hMDMs의 준비 및 HIV-1 감염이다. 실제로, 차별화 된 대 식세포의 수율과 품질은 도너 사이 변화뿐만 아니라 10~40% 범위의 효율성과 감염율. 또한, IgG의-옵 소닌 - SRBCs의 준비는 이것이 그들의 인식을 유도하고 파편으로 대신 FcRγ 쇄 매개 식균 작용에 의해 통풍 관 수 있기 때문에, 적혈구의 손상을 방지하는 것이 중요하다. 최적의 옵 소닌은 효율적으로 식균 작용을 보장합니다.

HIV에 감염된 대 식세포 거주 Phagosome 운동은 BSL -3- 실험실 회전 디스크 공 초점 현미경에 BF 채널을 실시간으로 분석한다........

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Discussion

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이 기술은 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 감염의 백분율 도너 의존하기 때문에 우선, HIV-1에 의한 hMDMs의 제조 및 감염은 매우 중요하다. 잠재적으로 생체 내에서 바이러스에 의해 발생하는 대 식세포의 상태가 아니라 지금까지 특징되지 않았기 때문에 참고로, 우리는 이전에 감염 체외에서 편광되지 않은 대 식세포를 사용하기로 결정했습니다. 우리는 대 식세포는도없고 M1 M2임을 나타내는 여러 표면 마커의 발현을 확인하고, CD4 및 CCR5의 발현을 확인 하였다. 감염 속도는 변수이며, 10 ~ 40 %, 그리고 때로는 이하로 다양합니다. 이 현미경 하에서 HIV-1 감염의 형광 hMDM를 찾는 것은 어려울 수있다 이유 가변 감염률이다. 또한, 원심 분리 공정 후에 즉시 HIV-1 감염 세포를 발견하는 데 필요한 시간도 취득 개시까지의 지연을 초래할 수있다. 식균 작용은 synchronizatio없이 개시 될 수있다바인딩 및 원심 분리에 의해 생성 된 흡수 n은. 그러나이 옵션은 세포에 도.......

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Disclosures

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저자는 공개할 것이 없습니다.

Acknowledgements

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원고를 읽어주신 Jamil Jubrail 박사님께 감사드립니다. 이 연구는 CNRS, Inserm, Université Paris Descartes, Agence Nationale de la Recherche (2011 BSV3 025 02), Fondation pour la Recherche Médicale (FRM DEQ20130326518 GLB 박사 펠로우십 포함) 및 Agence Nationale de Recherche sur le SIDA et les hépatites virales (ANRS, CD에 대한 박사 후 펠로우십 포함)의 보조금으로 지원되었습니다. A. Dumas는 Université Paris Descartes와 Sidaction의 박사 펠로우십의 지원을 받았습니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Falcon 100mm TC 처리 세포 배양 접시Corning353003바이러스 생산용
유리 바닥 접시 35mm 코팅되지 않은 1.5MatTek corporationP35G-1.5-14-C케이스 인수용
Falcon 조직 배양 플레이트 6-wellThermo Fischer ScientificCorning. Inc. 353934인간 단핵구 유래 대식세포용
Ficoll-Plaque PLUSDominique Dutscher17-1440-03밀도 원심분리를 위한 용액 내 중성, 고도로 분지화, 고질량, 친수성 다당류
DPBS, 칼슘 없음, 마그네슘없음 Thermo Fischer Scientific14190-094RT
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 1x, liquid (High Glucose)GIBCO, Molecular probes31966-0214°C에서 보존; C ; HEK 세포 배양
RPMI 1640 배지 GLUTAMAX  보충 생명 기술61870-0104 °에서 보존; C; hMDM 문화
Fœ 탈 카프 세럼 (FCS) 유로바이오CVFSVF0001-20 °에서 보존; C ; decomplemented
페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/ml)Thermo Fischer Scientific15140-122-20 °에서 보존; C ; hMDM 배양
RPMI 1640 매체, 페놀 레드 없음 (10x 500 ml)Life technologies11835-105Warm in 37 ° 사용 전 C 수조; 식세포작용 분석법:
FuGENE6 Transfection 시약PromegaE26924°C 보존; C ; 바이러스 생산을 위해
양 적혈구 (SRBC)EurobioDSGMTN00-0Q4 °에서 Alsever 버퍼에 보존; C 사용 전
안티 양 적혈구 IgGMP Biomedicals558064 °에서 보존; C
소 혈청 알부민 열 충격 분율, pH 7, ≥ 98% 시그마A7906-20 °에서 보존; C
도립 현미경 DMI600Leica
Confocal Spinning Disk Unit  CSU-X1M1요코가와
491 nm, 50 mW, 레이저, COBOLT, CALYPSO,
HCX, PL, APO, CS, ObjectifLeica객관렌즈 ; 배율 100X ; 개구수 1.40 ; 이머젼 오일
CoolSnap HQ2 (FireWire) 카메라포토메트릭픽셀 크기 6.45 &마이크로; m x 6.45 &마이크로; m ; 정의 1,392 x 1,040 ; 14비트
Metamorph 7.7.5 소프트웨어로분자 장치현미경 제어용
GraphPad Prism 소프트웨어통계 분석용
, , , , 스 이미지 인코딩

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. The cell biology of phagocytosis. Annu. Rev. Pathol. 7, 61-98 (2012).
  2. Niedergang, F. Encyclopedia of Cell Biology. 2, Academic Press. Waltham, MA. 751-757 (2016).
  3. Blocker, A., Griffiths, G., Olivo, J. C., Hyman, A. A., Severin, F. F.

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Phagosome VelocityHIV 1 Infected MacrophagesConfocal MicroscopyPhagosome TrackingSheep Red Blood CellsGFP Expressing VirusBright Field ImagingZ Stack AcquisitionDistance CalculationVelocity Measurement

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