Fastsettelse av Zeta Potensielle via nanopartikkel trans Hastigheter gjennom en fleksibel membran nanopore: Ved hjelp av DNA-modifisert Partikler som et eksempel

Summary

Her benyttes en polyuretan avstembar nanopore integrert i en resistiv pulsføle teknikk for å karakterisere nanopartikler overflatekjemi via måling av partikkeltrans hastigheter, som kan brukes for å bestemme zeta-potensialet av individuelle nanopartikler.

Abstract

Nanopore teknologi, kjent under samle Resistive pulssensor (RPS), blir brukt til å påvise, kvantifisere og karakterisere proteiner, molekyler og nanopartikler. Fleksibel resistive puls sensing (trps) er en relativt ny tilpasning til RPS som inkorporerer en fleksibel pore som kan endres i sanntid. Her bruker vi trps å overvåke trans tider av DNA-modifiserte nanopartikler som de krysser den avstembare pore membranen som en funksjon av DNA-konsentrasjon og struktur (dvs. enkelt-trådet til dobbeltkjedet DNA).

Trps er basert på to Ag / AgCl-elektroder, atskilt av et elastomert pore membran som etablerer en stabil ionisk strøm på et påtrykt elektrisk felt. I motsetning til forskjellige optiske basert partikkel karakterisering teknologier kan trps karakterisere individuelle partikler blant et utvalg populasjon, slik at for multimodale prøver som skal analyseres med letthet. Her viser vi zeta potensialet målingervia partikkeltrans hastigheter på kjente standarder og bruke disse til å prøve analysetrans ganger, noe som resulterer i å måle zeta potensialet av disse analyttene.

I tillegg til å anskaffe gjennomsnitts Zeta potensielle verdier, er prøvene tatt målt ved hjelp av en partikkel-by-partikkelen perspektiv som viser mer informasjon om en gitt prøve gjennom prøvepopulasjonsfordelinger, for eksempel. Av slikt, demonstrerer denne metoden potensial innenfor sensing programmer for både medisinsk og miljømessige felt.

Introduction

Funksjonnanopartikler blir stadig mer populært som biosensorer i både medisinske og miljømessige felt. Muligheten til å forandre en nanopartikkel er overflatekjemi, med DNA, for eksempel, har vist seg nyttige for målrettet medikamentleveringssystemer ¹ og overvåknings DNA-protein interaksjoner ^2-4. En stadig vanligere nanopartikkel eiendommen blir brukt ved biologiske og i levering av legemiddel er superparamagnetisme ^5. Superparamagnetiske partikler (SPPS) er ekstremt anvendbare for identifisering og fjerning av spesifikke analytter fra komplekse blandinger, og kan gjøre dette med enkle bruk av en enkelt magnet. Når den er fjernet, analytten bundne partikler kan karakteriseres og analyseres passer til formålet.

Tidligere metoder for påvisning og karakterisering av nanopartikler inkluderer optiske teknikker som dynamisk lysspredning (DLS), ellers kjent som fotonkorrelasjonsspektroskopi. Selv om en high gjennomstrømning teknikk blir DLS begrenset til å være en gjennomsnittsbasert teknikk, og ved analyse av multimodale prøver uten tilsetning av spesialprogramvare, vil de større partikler gir et mye mer dominant signal, slik at noen av de mindre partiklene helt ubemerket ^6,7. Partikkel-for-partikkel-karakteriseringsteknikker er derfor mye mer fordelaktig å analysere nanopartikler og nanopartikkel funksjonaliserte systemer.

RPS baserte teknologier er basert rundt påføre et elektrisk felt til en prøve, og overvåkning av transportmekanismen av partiklene gjennom en syntetisk eller biologisk nanopore. En forholdsvis ny nanopartikkel påvisning og karakterisering teknikk basert på RPS er fleksibel resistive puls sensing (trps) ^8-16. Trps er et to-elektrodesystem adskilt av en elastomer, fleksibel membran pore. En avstembar pore fremgangsmåte gjør det mulig for analytter av et utvalg av form ¹⁷ og størrelse som skal måles, via deres transportmekanismer gjennom pore. Avstembare porene har tidligere vært anvendt for påvisning av små partikler (70-95 nm diameter) fremstilling av sammenlignbare resultater til andre teknikker som for eksempel transmisjons-elektronspektroskopi (TEM) ^10. Når et elektrisk felt påtrykkes, er en ionisk strøm observert og som partikler / molekyler passere gjennom porene, de midlertidig å blokkere pore, forårsaker en reduksjon av strømmen som kan defineres som en "blokade hendelse". Hver blokade arrangement er representativ for en enkelt partikkel, slik at hver partikkel i en prøve kan karakteriseres individuelt basert på blokaden størrelse, Δ Og full bredde halvt maksimum, FWHM, så vel som andre egenskaper blokade. Analysere individuelle partiklene når de passerer gjennom en nanopore er fordelaktig for multimodale prøver som trps kan vellykket og effektivt skille mellom en rekke partikkelstørrelser AmonGST en enkelt prøve. Fleksibel resistive puls sensing fullstørrelse ^10, Zeta potensielle ^12,18 og konsentrasjon ¹⁵ målinger samtidig i ett enkelt løp, og kan derfor fortsatt skille prøver av lik, om ikke den samme størrelsen av deres overflateladning ^19; en fordel over alternative dimensjonering teknikker.

Zeta potensial er definert som det elektrostatiske potensial på planet av skjær ^20, og beregnes ut fra partikkelhastigheter som de krysser en pore ^19. Zeta potensial målinger av individuelle partikler gir dermed innsikt i trans mekanismer og oppførselen til nanopartikkel-systemer i løsningen, verdifull informasjon for fremtiden til nanopartikkel analyse design for en rekke bruksområder. Particle-by-partikkel analyse av en slik art gjør det også mulig for spredning og distribusjon av Zeta potensielle verdier blant et utvalg befolkningen til å bli utforsket, noe som åpner for mer informasjon on reaksjonskinetikk (enkelt-trådet til dobbeltkjedet DNA, for eksempel) og partikkel-stabiliteter i oppløsning som skal oppnås.

Her beskriver vi en teknikk som oppdager og karakteriserer både umodifiserte og DNA-modifisert SPP overflater. Protokollen er beskrevet heri kan anvendes på en rekke uorganiske og biologiske nanopartikler, men vi demonstrere fremgangsmåten ved bruk av DNA-modifiserte overflater på grunn av deres brede spekter av applikasjoner. Teknikken gjør det mulig for brukeren å skille mellom enkelt-trådede og dobbelt-trådede DNA mål på en nanopartikkel overflate, basert på partikkeltranshastigheter gjennom et poresystemet og dermed deres zeta-potensialer.

Protocol

1. Gjør Fosfatbufret saltløsning med Tween-20 (PBST) Buffer Oppløse en tablett PBS (0,01 M fosfatbuffer, 0,0027 M kaliumklorid, 0,137 M natriumklorid, pH 7,4) i 200 ml deionisert vann (18,2 Megohm cm). Tilsett 100 ul (0,05 (v / v))% Tween-20 i 200 ml bufferoppløsning som et overflateaktivt middel. 2. Forbereder karboksylsidekjeden polystyren Partikkel Standards Vortex kalibrerings partikler for 30 sekunder før ultralydbehandling i 2 minutter ved 80 …

Representative Results

Figur 1. Skjematisk fremstilling av prosesser av magnetiske rensing og et trps måling. A) Eksempel på magnetisk rensing av prøven starter med en prøve inneholdende overskudd av ubundet capture probe DNA. B) trps måling eksempel i) Partikkel passerer gjennom nanopore og ii) Blokade arrangement fremstilt fra partikkel midlertidig tyggende ioner i pore forårsaker e…

Discussion

Beregningen for zeta potensialet brukt en kalibreringsbasert metode relatert til arbeid med Arjmandi et al. ^21. Varigheten av translokasjon av partikler som de krysser et nanopore måles som en funksjon av påtrykt spenning, ved hjelp av en gjennomsnittlig elektriske felt og partikkelhastigheter over helheten av en vanlig konisk pore. Den elektroforetiske mobilitet er den deriverte av 1 / T (hvor T er varigheten blokaden) med hensyn til spenning, multiplisert med kvadratet av avfølingssonen le…

Materials

Phosphate buffered Saline (PBS)	Sigma Aldrich, UK	P4417	1 tablet dissolved in 200 mL deionised water to make buffer solution.
Tween-20	Sigma Aldrich, UK	P1379	0.05% (v/v) in PBS buffer as a surfactant
Carboxyl polystyrene nanoparticles	Bangs Laboratories, US	CPC200	Nominal diamter of 220 nm, raw concentration of 1E12 particles/mL, specific surface charge of 86 µeq/g (equivalent to a surface charge density of 3.2E19 C/nm^2.
Streptavidin coated nanoparticles	Ademtech, France	3121	Batch had binding capacity of 4352 pmol/mg (188 nM theoretical DNA binding capacity) at a raw concentration of 1.1E11 particles/mL.
Biotinylated oligonucleotides	Sigma Aldrich, UK	VC00001	Supplier spec: Reverse Phase 1 purification (0.05 Scale); Biotin modification at 3' end; Lyophilised powders reconstituted to 100 µM using deionised water, and diluted as required. Sequences: CP 5'ATGGTTAAACCTCAC TACGCGTGGC[Btn]3'
Standard olignonucleotides	Sigma Aldrich, UK	VC00001	Supplier spec: Reverse Phase 1 purification (0.05 Scale); Lyophilised powders reconstituted to 100 µM using deionised water, and diluted as required. Sequences of DNA targets: Fully complementary – 5'GCCACGCGTAGTGAGGTTTAACCAT3', Middle binding – 5'GTAGTGAGGT3', End binding – 5'GTTTAACCAT3', Partially complementary overhanging – 5'GTGAGGTTTAACCAT TTTTTTTTTTTTTTT3'.
Izon qNano	Izon Science, NZ		Inherent pressure on system of 47 Pa,
Izon Variable Pressure Module (VPM)	Izon Science, NZ		Each 'cm' of pressure is equivalent to approximately 1000 Pa.
Polyurethane nanopore membranes	Izon Science, NZ	NP150	Analyte size range 60-480 nm, pore diameter of calculated to be 799 nm at a 45 mm stretch.
Magrack 6	GE Healthcare, UK	28-9489-64
Sonic Bath	Fisher Scientific, UK	10692353	80 Watts
Vortexer	IKA, Germany	0003365000
Rotary Wheel	Labnet International, US	H5500-230 V