måling af<em> In vitro</em> Integration aktivitet af HIV-1 Preintegration komplekser

Summary

This report describes an in vitro assay for measuring the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) preintegration complex (PIC)-associated integration activity in the cytoplasmic extracts of acutely infected cells. The integration of PIC-associated HIV-1 DNA into heterologous target DNA is quantified by using a nested real-time polymerase chain reaction strategy.

Abstract

HIV-1-kappeproteiner engagere beslægtede receptorer på målcellen overflade, hvilket fører til viral-cellemembranen fusion efterfulgt af frigivelsen af ​​det virale capsid (CA) kerne ind i cytoplasmaet. Efterfølgende den virale reverse transkriptase (RT), som en del af en navnebror nukleoprotein kompleks betegnes revers transkription Complex (RTC), konverterer det virale enkeltstrenget RNA-genom ind i en dobbeltstrenget DNA-kopi (vDNA). Dette fører til biogenesen af ​​anden nukleoprotein kompleks, betegnet præ-integration komplekset (PIC), sammensat af vDNA og associerede virusproteiner og vært faktorer. PIC-associeret viral integrase (IN) orchestrates integrering af vDNA i værtens kromosomale DNA i en tidsmæssigt og rumligt reguleret totrinsproces. For det første har i processer 3'-enderne af vDNA i cytoplasmaet, dels efter PIC trafikker til kernen, den medierer integration af det forarbejdede vDNA i det kromosomale DNA. De ansvarlige isoleretfra målceller akut inficeret med HIV-1 er funktionelle in vitro, da de er kompetente til at integrere den tilknyttede vDNA til et exogent tilsat heterologt mål-DNA. En sådan PIC-baserede in vitro integration analyser har bidraget væsentligt til at afgrænse de mekanistiske detaljer i retroviral integration og til at opdage IN hæmmere. I denne rapport, vi uddybe en opdateret HIV-1 PIC assay, der anvender en indlejret real-time kvantitativ polymerasekædereaktion (qPCR) -baseret strategi til måling af in vitro-integration aktivitet af isolerede indfødte ansvarlige.

Introduction

HIV-1-replikation i målcellen involverer flere trin, generelt inddeles i to faser: tidlige og sene begivenheder. De tidlige begivenheder begynder, når HIV-1 sekventielt binder til målet celleoverfladereceptoren CD4 og en af de to co-receptorer (CCR5 eller CXCR4) ^1. Følgelig virus-celle membraner lunte, og det virale capsid (CA) kerne frigives til cytoplasmaet ^2. CA kerne indeholder det virale genomiske enkeltstrenget RNA (ssRNA) og adskillige proteiner, både virale og cellulære oprindelse. Ca-associerede virale proteiner indbefatter revers transkriptase (RT) og integrase (IN), to enzymer, der medierer kritiske trin i de tidlige begivenheder i virusreplikation. RT og IN-funktionen i forbindelse med nukleoprotein komplekser, nemlig revers transkription Complex (RTC) og præ-integration komplekset (PIC), henholdsvis ^{3, 4, 5} <sup>, ^6. Enderne af det virale genom ssRNA harbour terminale gentagelse (R) elementer støder op til de unikke sekvenser U5 (ved 5'-enden) og U3 (ved 3 'enden). RTC konverterer det virale ssRNA genomet i en dobbeltstrenget (ds) DNA-kopi (vDNA). Denne revers transkription proces resulterer også i overlapning af U5 og U3 sekvenser, hvorved der genereres lange terminale gentagelser (LTR) ved begge ender af vDNA ^{7, 8.} Efterfølgende PIC-associerede IN katalyserer to sekventielle biokemiske reaktioner, der muliggør integrationen af vDNA i værtskromosomet ^{9, 10, 11.} Først, i cytoplasmaet, IN multimerer engagere både LTR'er ¹² og spalte en dinukleotid fra hver af de 3'-terminale ender. Dette 3'-end behandling genererer en hydroxylgruppe ved hver 3'-ende (CA _OH) i vDNA.Dernæst PIC trafikker til kernen, hvor i anvender vDNA CA _OH som en nukleofil til at skære begge strenge af det kromosomale DNA i en forskudt måde. Samtidig IN splejsninger koordineret begge ender af vDNA til de resulterende phosphodiesterbindinger på modsatte strenge af det kromosomale DNA. Efter denne streng transfer trin, værtscellen maskiner fjerner to uparrede nukleotider i 5'enderne af vDNA og reparationer de følgende enkeltstrengede huller ved krydset af integrationen site. De tidlige begivenheder således kulminere med etableringen af ​​et integreret DNA-kopi (provirus) af HIV-1-genomet. Proviruset tilvejebringer et egnet miljø for effektiv viral genekspression, som initierer senere begivenheder, herunder ekspressionen af ​​virus-kodede proteiner; samling af umodne virus; og spirende, frigivelse, og modning i infektiøse viruspartikler ^13.

Renset rekombinant retroviral IN er kompetent til atudføre, in vitro, både 3'-end forarbejdning og streng transferaktiviteter på eksogent leveret LTR-lignende substrat DNA. Biokemiske undersøgelser under anvendelse sådan oprenset rekombinant IN har afsløret kritiske aspekter af vDNA integration ^{14, 15, 16, 17.} Men i modsætning til i naturlig infektion, dette in vitro biokemisk reaktion understøtter ikke samordnede integration af begge ender af substrat-DNA ind i mål-DNA. I modsætning hertil retrovirale PIC'er isoleret fra akut inficerede celler samordnet for at integrere begge ender af det endogene vDNA til heterolog mål-DNA. Dette førte til udbredt anvendelse og efterfølgende justeringer af I n Vitro Integration (IVI) analyser ved hjælp isolerede indfødte ansvarlige.

I den første rapporterede retrovirale IVI assay cytoplasmatiske ekstrakter fra celler inficeret med en rekombinant murinLeukæmi Virus (MLV) huser E. coli supF-genet i sin LTR tjent som kilden til IN-aktivitet, og DNA'et af en mutant lambda-fag defekt i lytisk vækst blev eksogent leveret som target-DNA'et. Vellykket integration af det rekombinante MLV DNA kopiere, i fag-DNA'et og den efterfølgende supF ekspression førte til restaurering af plaque-dannende evne af de rekombinante fager. Men denne eksperimentelle strategi er besværlig og foranstaltninger integration på en indirekte måde. For at imødegå sådanne forbehold, blev en Southern blot-baserede indirekte ende-mærkning assay, der kvantificerer PIC-associerede IVI aktivitet som et mål for den endogene vDNA integreret i eksogen lineariserede bakteriofag phiX174 DNA, udviklet ^{6, 7, 18.} Selv om denne metode giver et direkte mål for integration begivenheder, er relativt høje mængder af PIC forberedelse kræves, som stadig er et teknisk udfordrendebestræbelse. For at omgå dette, blev indlejrede PCR-baserede analyser, der kræver kun beskedne mængder af PIC'er udviklet ^{4, 5, 19.}

I denne rapport beskriver vi en opdateret version af et nested PCR-baserede in vitro-metode udviklet til at rekapitulere HIV-1 PIC-medieret integration aktivitet forekommer under naturlig infektion. Denne metode anvender cytoplasmatiske ekstrakter af HIV-1-inficerede målceller som en kilde til endogen PIC-aktivitet, som måles med en real-time kvantitativ polymerasekædereaktion (qPCR). Procedurerne for at isolere ansvarlige og måle deres integrationsaktiviteter tilpasses, med modifikationer, fra protokoller offentliggjort af Engelman laboratoriet ^20. Ved denne fremgangsmåde er PIC-associerede integration aktivitet initieres ved at tilvejebringe en eksogen lineær mål-DNA ^21, og DNA, der stammer fradenne integration reaktion oprenses og anvendes som udgangsmateriale til efterfølgende PCR-baserede kvantificering. I første runde konventionel PCR er de virale-mål-DNA junctions amplificeret ved anvendelse af passende primere. I anden runde qPCR, er LTR-specifikke primere anvendes til specifikt at berige vDNA befolkning fra første runde PCR-produkter. Se afsnittet protokol for en detaljeret beskrivelse af denne metode.

In vitro studier med retrovirale ansvarlige har ført til betydelige fremskridt i vores forståelse af mekanismen for retroviral DNA integration og i udviklingen af IN-hæmmere. Baseret på den seneste øget fokus på kortlægning af HIV-1 integration sites, bestemme rolle af virale og vært faktorer i HIV-1 integration, og udvikle nye antivirale lægemidler til bekæmpelse af resistens, vi forestiller en øget interesse i og udbredt brug af IVI assays , som den er beskrevet i denne rapport. Dette vil igen, vil føre tilfremtidige forbedringer i metoden, og dermed diversificere omfanget af dets applikationer.

Protocol

1. Virus Production BEMÆRK: For at generere høje titre af infektiøs HIV-1, transficere humane embryoniske nyre (HEK) cellelinie 293T med en infektiøs HIV-1 molekylære klon ved anvendelse af en aktiveret dendrimer-baserede transfektionsreagens. Det er blevet observeret, at calciumphosphat-transfektion metode giver sammenlignelige resultater. I en biosikkerhedsniveau 2 (BSL2) lab, frø 3 x 10 6 293T celler pr 10 cm skål i 8 ml Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) …

Representative Results

Isolering af HIV-1-PIC'er En skematisk af den anvendte protokol til isolering af HIV-1-PIC'er fra akut inficerede Sup-T1-celler er afbildet i figur 1. Denne protokol er afledt af fremgangsmåderne beskrevet af Engelman et al. 19, 20. HIV-1-PIC'er er nukleoprotein komplekser, der er samlet i inficerede celler og er …

Discussion

Biokemiske analyser af retrovirale PIC'er har givet kritiske indsigt i mekanismen for retroviral DNA-integration. Måling af integration aktivitet af retrovirale PIC'er kan opnås ved plakdannelse assay Southern blot-analyse, og nested qPCR. Den eksperimentelle strategi af plak-assay er besværlig og udnytter en indirekte metode til måling af integration ^{6, 7, 18.} Southern blot assays foranstaltning integration direkte…

Materials

Fetal bovine serum (FBS)	GIBCO/Invitrogen	10437-028
Heat-inactivated Fetal bovine serum (Hi-FBS)	GIBCO/Invitrogen	10438-026
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	GIBCO/Invitrogen	11995-065
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium	GIBCO/Invitrogen	11875-093
Phosphate buffered saline (PBS) (1X)	GIBCO/Invitrogen	20012-027
Trypsin-EDTA (0.25%)	GIBCO/Invitrogen	25200-056
Penicillin-Streptomycin solution (100x)	Cellgro/Mediatech	30-002-CI
HEK293T cells (293T)	American Type Culture Collection (ATCC)	CRL-3216
HIV-1 proviral molecular clone pNL4-3	NIH AIDS Research and Reference Reagent Program	114
PolyFect transfection reagent	Qiagen	301107
DNase	Calbiochem/Merckmillipore	260913
Immulon 2HB 96-well plates	Thermo Scientific	3455
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
ELISA coating antibody: anti-CA-183-H12-5C monoclonal antibody	NIH AIDS Research and Reference Reagent Program	1513
ELISA wash solution (0.2% Tween-20 in PBS)	—	—
Donor bovine serum	Gibco/Invitrogen	16030074
Blocking Buffer (5% donor bovine serum in PBS) – Prepare fresh before use.	—	—
Sample diluent (SD) buffer (10% donor bovine serum and 0.5% Triton X-100 in PBS) – Sterilize using 0.22 micron pore-size syringe filter and store aliquots at 4°C.	—	—
Recombinant p24 protein (Full-length CA protein was expressed from pET21a-CA plasmid in E. coli BL21-DE3 and purified as described in Ref # —-)	Dr. Wesley Sundquist	—
HIV IgG	NIH AIDS Research and Reference Reagent Program	3957
Goat anti-human IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, HRP conjugate	Pierce/ThermoFisher	31412
TMB Microwell Peroxidase substrate system	KPL, Inc.	50-76-00
SupT1 cells	American Type Culture Collection (ATCC)	CRL-1942
HEPES pH 7.2-7.5 (ready-to-use solution)	GIBCO/Invitrogen	15630-080
Potassium chloride (KCl) solution	Sigma-Aldrich	60142
Magnesium chloride (MgCl2) solution	Sigma-Aldrich	M1028
Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	43815
Aprotinin	Sigma-Aldrich	A6106
Digitonin	Sigma-Aldrich	D141
RNase A	Invitrogen	12091-021
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
phiX174 Replicative Form 1 DNA	Promega	D1531
PhiX174-F primer: 5’-CGCTTCCATGACGCAGAAGTT-3’ PhiX174-R primer: 5’-CACTGACCCTCAGCAATCTTA-3’	Invitrogen and/or IDT-DNA
dNTP mix	Promega	U1515
Go Taq DNA Polymerase	Promega	M3005
Qiaquick gel extraction kit	Qiagen	28706
Ultrapure distilled water	Invitrogen	10977-015
Tris-EDTA (TE) buffer (100X)	Sigma-Aldrich	T9285
Sodium dodecyl sulphate (SDS)	Sigma-Aldrich	L3771
Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt (EDTA) solution, 0.5 M, pH 8.0	Sigma-Aldrich	E7889
Proteinase K (20 mg/ml ready-to-use solution)	Qiagen	19131
Phenol (equilibrated with 10 mM Tris HCl, pH 8.0 and 1 mM EDTA)	Sigma-Aldrich	P4557
Chloroform	Sigma-Aldrich	288306
Glycogen (5 mg/ml solution)	Ambion/Invitrogen	AM9510
Sodium acetate (3M, pH 5.2)	Sigma-Aldrich	57899
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023
First round LTR primer: 5’-GTGCGCGCTTCAGCAAG-3’) First round phiX174 primer: 5’-CACTGACCCTCAGCAATCTTA-3’	Invitrogen and/or IDT-DNA	—
Second round LTR-R primer: 5’-TCTGGCTAACTAGGGAACCCA-3’ Second round LTR-U primer: 5’-CTGACTAAAAGGGTCTGAGG-3’; Second round Taqman probe:  5’-56– FAM/TTAAGCCTCAATAAAGCTTGC CTTGAGTGC/36-TAMRA/-3’	Invitrogen and/or IDT-DNA	—
iQ Supermix	Bio-Rad	170-8862