Messung von<em> In Vitro</em> Integration Aktivität von HIV-1 Preintegration Komplexe

Summary

This report describes an in vitro assay for measuring the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) preintegration complex (PIC)-associated integration activity in the cytoplasmic extracts of acutely infected cells. The integration of PIC-associated HIV-1 DNA into heterologous target DNA is quantified by using a nested real-time polymerase chain reaction strategy.

Abstract

HIV-1-Hüllproteine ​​eingreifen verwandten Rezeptoren auf der Zielzellenoberfläche, die durch die Freisetzung des viralen Capsid (CA) Kern in das Cytoplasma, gefolgt viral-Zellmembranfusion führt. Anschließend bezeichnet der virale Reverse Transkriptase (RT), als Teil eines gleichnamigen Nukleoproteinkomplex der reversen Transkription Complex (RTC), wandelt den viralen einzelsträngige RNA-Genom in eine doppelsträngige DNA-Kopie (vDNA). Dies führt zur Biogenese von anderen Nukleoprotein-Komplex, bezeichnet als die Präintegrationskomplexes (PIC), der sich aus der vDNA und assoziierter Virus-Proteinen und Wirtsfaktoren. Der PIC-assoziierten viralen Integrase (IN) orchestriert die Integration der vDNA in die chromosomale Wirts-DNA in einer zeitlich und räumlich reguliert zweistufiger Prozess. Zunächst verarbeitet die in der 3'-Enden des vDNA im Zytoplasma und zweitens, nachdem der PIC an den Kern Verkehre, sie vermittelt Integration der verarbeiteten vDNA in die chromosomale DNA. Die PICs isoliertvon Zielzellen sind akut mit HIV-1 infiziert in vitro funktionell, da sie kompetent sind den zugehörigen vDNA in eine exogen zugesetztem heterologe Ziel – DNA zu integrieren. Solche PIC-basierte in vitro Integrationstests haben die mechanistischen Details der retroviralen Integration abgrenzen und zu entdecken IN Inhibitoren beigetragen. In diesem Bericht erarbeiten wir auf einem aktualisierten HIV-1 PIC Test, der zur Messung der in vitro Integration Aktivität von isolierten nativen PICs eine verschachtelte quantitative Echtzeit – Polymerase – Kettenreaktion (qPCR) -basierte Strategie beschäftigt.

Introduction

HIV-1-Replikation in der Zielzelle umfasst mehrere Schritte, im Großen und Ganzen gruppiert in zwei Phasen: frühe und späte Ereignisse. Die frühen Ereignisse beginnen , wenn HIV-1 sequentiell an den Oberflächenrezeptor Zielzelle bindet , CD4 und einem der beiden Co-Rezeptoren (CCR5 oder CXCR4) ^1. Folglich wird die Virus-Zellmembranen verschmelzen, und das virale Capsid (CA) Kern in das Zytoplasma ² freigegeben. Die CA Kern enthält die virale genomische einzelsträngige RNA (ssRNA) und mehrere Proteine, sowohl viralen und zellulären Ursprungs. Die CA-assoziierten viralen Proteine ​​umfassen Reverse Transkriptase (RT) und Integrase (IN), zwei Enzyme, die während der frühen Ereignisse in der viralen Replikation kritischen Schritte vermitteln. Die RT und IN – Funktion in Zusammenhang mit Nucleoprotein – Komplexe, nämlich die reverse Transkription Complex (RTC) und das Präintegrationskomplexes (PIC), die jeweils ^{3, 4, 5} <sup>, ^6. Die Enden des viralen Genoms ssRNA Hafen terminal repeat (R) Elemente benachbart zu der einzigartigen Sequenzen U5 (am 5'-Ende) und U3 (am 3'-Ende). Die RTC wandelt das virale ssRNA-Genom in eine doppelsträngige (ds) DNA-Kopie (vDNA). Diese umgekehrte Transkriptionsprozess resultiert auch in Duplizierung der U5 und U3 – Sequenzen, so lange terminale Wiederholungen (LTR) an beiden Enden der vDNA ^{7, 8} zu erzeugen. Anschließend katalysiert das PIC-assoziiertes in zwei aufeinanderfolgenden biochemischen Reaktionen, die die Integration der vDNA in das Wirtschromosom ^{9, 10, 11} ermöglichen. Zuerst wird im Zytoplasma, IN Multimere Eingriff beide LTRs ¹² und ein Dinukleotid aus jeder der 3'-terminalen Enden abzuspalten. Diese 3'-End – Verarbeitung erzeugt an jedem 3'-Ende (CA _OH) der vDNA eine Hydroxylgruppe.Als nächstes Verkehre PIC an den Kern, wobei in der vDNA CA _OH als Nucleophil verwendet beide Stränge der chromosomalen DNA in einer gestaffelten Art und Weise zu schneiden. Gleichzeitig Spleiße IN koordinativ an beiden Enden der vDNA der resultierenden Phosphodiesterbindungen auf gegenüberliegenden Stränge der chromosomalen DNA. Im Anschluss an diese Strangtransferschritt entfernt die Wirtszelle Maschinen die beiden ungepaarten Nukleotide am 5'-Enden der vDNA und repariert die folgenden einsträngige Lücken an der Kreuzung von der Integrationsstelle. Die frühen Ereignisse also mit der Einrichtung eines integrierten DNA-Kopie (Provirus) des HIV-1-Genoms gipfeln. Das Provirus stellt eine geeignete Umgebung für die effiziente virale Genexpression, die einschließlich der Expression der Virus-kodierten Proteinen spätere Ereignisse initiiert; Montage des unreifen Virus; und Knospung, Release und Reifung in infektiöse Virionen ^13.

Gereinigte rekombinante retrovirale IN ist zuständigdurchzuführen, in vitro, beide 3'-End – Verarbeitung und Strangtransferaktivitäten auf exogen zugeführt LTR artiges Substrat – DNA. Biochemische Untersuchungen so gereinigte rekombinante bei der Verwendung haben ergeben , kritische Aspekte der vDNA Integration ^{14, 15, 16, 17.} Jedoch anders als in natürlichen Infektion, diese in vitro biochemische Reaktion unterstützt nicht abgestimmten Integration beider Enden der Substrat – DNA in das Ziel – DNA. Im Gegensatz dazu integrieren Retrovirus PICs isoliert aus akut infizierten Zellen concertedly beide Enden des endogenen vDNA in heterologe Ziel-DNA. Dies führte zu der weit verbreiteten Annahme und nachfolgende Verfeinerungen von I n – vitro – Integration (IVI) Assays isoliert nativen PICs mit.

In der ersten berichteten retroviralen IVI-Assay, Zytoplasmaextrakte von Zellen mit einem rekombinanten Mäuse infiziertLeukemia Virus (MLV) , um das E. coli supF – Gen in seiner LTR beherberge diente als Quelle der IN – Aktivität und der DNA eines mutierten Lambda – Phagen – defekt in das lytische Wachstum wurde exogen als die Ziel – DNA zugeführt. Erfolgreiche Integration der rekombinanten DNA MLV Kopieren in die Phagen-DNA und die Expression supF anschließenden führte zur Wiederherstellung der Plaque-bildenden Fähigkeit der rekombinanten Phagen. Allerdings ist diese experimentellen Strategie ist mühsam und Maßnahmen Integration in indirekter Weise. Um solche Einschränkungen, ein Southern – Blot-basierte indirekte Endmarkierung Assay adressieren, die die PIC-assoziiertes IVI Aktivität als Maß für das endogene vDNA in exogene linearisierte Bakteriophage phiX174 – DNA integriert quantifiziert wurde ^{6 entwickelt, 7, 18.} Obwohl dieses Verfahren ein direktes Maß der Integrationsereignisse liefert, relativ hohe Mengen an PIC Herstellung erforderlich sind, was eine technisch anspruchsvolle bleibtbemühen. Um dies zu umgehen, Nested-PCR – basierte Assays erfordern nur geringe Mengen an PICs wurden ^{4, 5 entwickelt, 19.}

In diesem Bericht beschreiben wir eine aktualisierte Version von einer verschachtelten PCR-basierten In – vitro – Methode entwickelt , um die HIV-1 – PIC-vermittelte Integration Aktivität zu rekapitulieren während einer natürlichen Infektion auftreten. Diese Methode verwendet die zytoplasmatischen Extrakten von HIV-1-infizierten Zielzellen als eine Quelle für endogene PIC-Aktivität, die mit einem quantitativen Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) gemessen wird. Die Verfahren für die PICs zu isolieren und ihre Integrationsaktivitäten Messung angepasst sind, mit Modifikationen, von Protokollen , die vom Engelman Labor veröffentlicht ^20. In diesem Verfahren wird die PIC-assoziiertes Integrations Aktivität initiiert durch eine exogene lineare Ziel – DNA ²¹ bietet, und die DNA – Produkte ausDiese Integrationsreaktion werden gereinigt und als Ausgangsmaterial für die nachfolgende PCR-basierte Quantifizierung verwendet. In der ersten Runde konventionellen PCR, die viral-Ziel-DNA-Übergänge unter Verwendung geeigneter Primer amplifiziert. In der zweiten Runde qPCR, LTR-spezifische Primer verwendet werden, um spezifisch die vDNA Bevölkerung aus der ersten Runde der PCR-Produkte bereichern. Bitte beachten Sie die Protokollabschnitt für eine detaillierte Beschreibung dieses Verfahrens.

In – vitro – Studien mit retroviralen PICs haben zu erheblichen Fortschritten im Verständnis des Mechanismus der retroviralen DNA – Integration und in der Entwicklung von IN Inhibitoren geführt. Basierend auf der jüngsten verstärkten Fokus auf Mapping-HIV-1-Integrationsstellen, die Rolle von viralen und Wirtsfaktoren in HIV-1-Integration zu bestimmen und die Entwicklung neuer antivirale Medikamente gegen Arzneimittelresistenz Bekämpfung erwarten wir ein verstärktes Interesse an und weit verbreiteten Einsatz von IVI-Assays , wie die in diesem Bericht beschrieben ein. Dies wiederum, führt zuZukunft Verfeinerungen bei dem Verfahren Diversifizierung dadurch den Umfang seiner Anwendungen.

Protocol

1. Virus-Produktion HINWEIS: Um die hohe Titer von infektiösen HIV-1 erzeugen, transfizieren die menschliche embryonale Nieren (HEK) Zelllinie 293T mit einem infektiösen HIV-1 molekularen Klon ein aktiviertes Dendrimer-basierten Transfektionsreagenz verwenden. Es wurde beobachtet, dass das Calciumphosphat-Transfektionsverfahren vergleichbare Ergebnisse ergibt. In einer biologischen Sicherheitsstufe 2 (BSL2) lab, seed 3 x 10 6 293T – Zellen pro 10 cm – Schale in 8 ml D…

Representative Results

Isolierung von HIV-1 PICs Ein Schema des Protokolls für die Isolierung von HIV-1 PICs von akut infizierten Sup-T1 – Zellen verwendet , ist in Abbildung 1 dargestellt. Dieses Protokoll wird von den Methoden von Engelman et al beschrieben abgeleitet. 19, 20. HIV-1 PICs sind Nucleoprotein – Komplexe , die in infizierten Zellen z…

Discussion

Biochemische Analysen von retroviralen PICs haben kritische Einblicke in den Mechanismus der retroviralen DNA-Integration zur Verfügung gestellt. Die Messung der Integration Aktivität von retroviralen PICs kann durch die Bildung von Plaque-Assay, Southern-Blot-Analyse und verschachtelte qPCR erreicht werden. Die experimentelle Strategie der Plaque – Assay ist arbeitsaufwendig , und verwendet eine indirekte Methode ⁶ Integration zu ^{messen, 7,} <sup cl…

Materials

Fetal bovine serum (FBS)	GIBCO/Invitrogen	10437-028
Heat-inactivated Fetal bovine serum (Hi-FBS)	GIBCO/Invitrogen	10438-026
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	GIBCO/Invitrogen	11995-065
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium	GIBCO/Invitrogen	11875-093
Phosphate buffered saline (PBS) (1X)	GIBCO/Invitrogen	20012-027
Trypsin-EDTA (0.25%)	GIBCO/Invitrogen	25200-056
Penicillin-Streptomycin solution (100x)	Cellgro/Mediatech	30-002-CI
HEK293T cells (293T)	American Type Culture Collection (ATCC)	CRL-3216
HIV-1 proviral molecular clone pNL4-3	NIH AIDS Research and Reference Reagent Program	114
PolyFect transfection reagent	Qiagen	301107
DNase	Calbiochem/Merckmillipore	260913
Immulon 2HB 96-well plates	Thermo Scientific	3455
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
ELISA coating antibody: anti-CA-183-H12-5C monoclonal antibody	NIH AIDS Research and Reference Reagent Program	1513
ELISA wash solution (0.2% Tween-20 in PBS)	—	—
Donor bovine serum	Gibco/Invitrogen	16030074
Blocking Buffer (5% donor bovine serum in PBS) – Prepare fresh before use.	—	—
Sample diluent (SD) buffer (10% donor bovine serum and 0.5% Triton X-100 in PBS) – Sterilize using 0.22 micron pore-size syringe filter and store aliquots at 4°C.	—	—
Recombinant p24 protein (Full-length CA protein was expressed from pET21a-CA plasmid in E. coli BL21-DE3 and purified as described in Ref # —-)	Dr. Wesley Sundquist	—
HIV IgG	NIH AIDS Research and Reference Reagent Program	3957
Goat anti-human IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, HRP conjugate	Pierce/ThermoFisher	31412
TMB Microwell Peroxidase substrate system	KPL, Inc.	50-76-00
SupT1 cells	American Type Culture Collection (ATCC)	CRL-1942
HEPES pH 7.2-7.5 (ready-to-use solution)	GIBCO/Invitrogen	15630-080
Potassium chloride (KCl) solution	Sigma-Aldrich	60142
Magnesium chloride (MgCl2) solution	Sigma-Aldrich	M1028
Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	43815
Aprotinin	Sigma-Aldrich	A6106
Digitonin	Sigma-Aldrich	D141
RNase A	Invitrogen	12091-021
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
phiX174 Replicative Form 1 DNA	Promega	D1531
PhiX174-F primer: 5’-CGCTTCCATGACGCAGAAGTT-3’ PhiX174-R primer: 5’-CACTGACCCTCAGCAATCTTA-3’	Invitrogen and/or IDT-DNA
dNTP mix	Promega	U1515
Go Taq DNA Polymerase	Promega	M3005
Qiaquick gel extraction kit	Qiagen	28706
Ultrapure distilled water	Invitrogen	10977-015
Tris-EDTA (TE) buffer (100X)	Sigma-Aldrich	T9285
Sodium dodecyl sulphate (SDS)	Sigma-Aldrich	L3771
Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt (EDTA) solution, 0.5 M, pH 8.0	Sigma-Aldrich	E7889
Proteinase K (20 mg/ml ready-to-use solution)	Qiagen	19131
Phenol (equilibrated with 10 mM Tris HCl, pH 8.0 and 1 mM EDTA)	Sigma-Aldrich	P4557
Chloroform	Sigma-Aldrich	288306
Glycogen (5 mg/ml solution)	Ambion/Invitrogen	AM9510
Sodium acetate (3M, pH 5.2)	Sigma-Aldrich	57899
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023
First round LTR primer: 5’-GTGCGCGCTTCAGCAAG-3’) First round phiX174 primer: 5’-CACTGACCCTCAGCAATCTTA-3’	Invitrogen and/or IDT-DNA	—
Second round LTR-R primer: 5’-TCTGGCTAACTAGGGAACCCA-3’ Second round LTR-U primer: 5’-CTGACTAAAAGGGTCTGAGG-3’; Second round Taqman probe:  5’-56– FAM/TTAAGCCTCAATAAAGCTTGC CTTGAGTGC/36-TAMRA/-3’	Invitrogen and/or IDT-DNA	—
iQ Supermix	Bio-Rad	170-8862