Misurazione<em> In Vitro</em> Integrazione di attività del virus HIV-1 preintegrazione Complessi

Summary

This report describes an in vitro assay for measuring the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) preintegration complex (PIC)-associated integration activity in the cytoplasmic extracts of acutely infected cells. The integration of PIC-associated HIV-1 DNA into heterologous target DNA is quantified by using a nested real-time polymerase chain reaction strategy.

Abstract

proteine ​​HIV-1 busta impegnano recettori cognate sulla superficie delle cellule bersaglio, che porta a fusione della membrana virale delle cellule seguita dal rilascio del nucleo capside virale (CA) nel citoplasma. Successivamente, il virale trascrittasi inversa (RT), come parte di un complesso omonimo nucleoproteina definito il trascrizione inversa Complex (RTC), converte il virale genoma RNA a singolo filamento in una copia di DNA a doppio filamento (vDNA). Questo porta alla biogenesi di un altro complesso nucleoproteina, chiamato il complesso di pre-integrazione (PIC), composto dal vDNA e proteine ​​del virus associati e fattori dell'ospite. L'integrasi virale PIC-associato (IN) orchestra l'integrazione della vDNA nel DNA cromosomico host in un processo in due fasi temporalmente e spazialmente regolamentato. Innanzitutto, l'IN elabora estremità 3 'della vDNA nel citoplasma e, dall'altro, dopo il PIC traffici al nucleo, essa media integrazione del vDNA trasformata nel DNA cromosomico. I PIC isolatida cellule bersaglio con infezione acuta da HIV-1 sono funzionali in vitro, in quanto sono competenti per integrare il vDNA associato in un DNA bersaglio eterologo esogena aggiunto. Tale PIC-based nei test di integrazione in vitro hanno contribuito in modo significativo a delineare i dettagli meccanicistici di integrazione retrovirale e alla scoperta IN inibitori. In questo rapporto, elaboriamo su un test HIV-1 PIC aggiornato che si avvale di un annidato in tempo reale Polymerase Chain Reaction quantitativa (qPCR) strategia basata su per misurare l'attività in vitro integrazione di isolati PIC nativi.

Introduction

Replicazione dell'HIV-1 nella cella di destinazione prevede più passaggi, in linea di massima raggruppati in due fasi: eventi precoci e tardive. Gli eventi precoci iniziano quando HIV-1 in sequenza si lega alla superficie del recettore cellula bersaglio CD4 e una delle due co-recettori (CCR5 o CXCR4) ^1. Di conseguenza, le membrane fusibile virus-cellula, e il capside virale (CA) nucleo viene rilasciato nel citoplasma ^2. Il nucleo CA contiene il genomico RNA virale a singolo filamento (ssRNA) e diverse proteine, sia virali e cellulare in origine. Le proteine ​​virali CA-associati includono trascrittasi inversa (RT) e integrasi (IN), due enzimi che mediano passaggi critici durante eventi precoci nella replicazione virale. La RT ed in funzione nel contesto di complessi nucleoproteina, cioè la trascrizione inversa Complex (RTC) e il complesso di pre-integrazione (PIC), rispettivamente ^{3, 4, 5} <sup>, ^6. Le estremità del virale ssRNA genoma porto terminale di ripetizione (R) elementi adiacenti alla unica sequenze U5 (al 5 ') e U3 (al 3'). Il RTC converte il genoma virale ssRNA in un (ds) copia di DNA a doppia elica (vDNA). Questo processo di trascrizione inversa provoca anche la duplicazione delle U5 e U3 sequenze, generando così ripetizioni terminali lunghe (LTR) ad entrambe le estremità del vDNA ^{7, 8.} Successivamente, il IN PIC-associata catalizza due reazioni biochimiche sequenziali che consentono l'integrazione del vDNA nel cromosoma ospite ^{9, 10, 11.} Innanzitutto, nel citoplasma, IN multimeri coinvolgere sia LTR ¹² e fendere un dinucleotide da ciascuna delle estremità 3'-terminali. Questa elaborazione 3'-end genera un gruppo ossidrilico ad ogni 3'-end (CA _OH) del vDNA.Avanti, PIC traffici al nucleo, in cui IN utilizza il vDNA CA _OH come nucleofilo per tagliare entrambi i filamenti di DNA cromosomico in modo sfalsato. Contemporaneamente, IN giunzioni coordinatamente due estremità del vDNA ai legami fosfodiestere risultanti sui filamenti opposti del DNA cromosomico. A seguito di questa fase di trasferimento filone, il macchinario cellula ospite rimuove i due nucleotidi spaiati alle estremità 5 'del vDNA e riparazioni le conseguenti lacune singolo filamento allo svincolo del sito di integrazione. I primi eventi culminano quindi con la creazione di una copia di DNA integrato (provirus) del virus HIV-1 genoma. Il provirus fornisce un ambiente adatto per l'espressione genica virale efficiente, che avvia eventi successivi, compreso l'espressione delle proteine ​​virali codificate; assemblaggio del virus immaturo; e in erba, il rilascio e la maturazione in virioni infettivi ^13.

Purificata ricombinante retrovirale IN è competente aeffettuare, in vitro, sia attività di trasformazione e di trasferimento filo 3'-end in modo esogeno forniti LTR-come il DNA substrato. Studi biochimici utilizzando tali ricombinante purificata hanno rivelato aspetti critici vDNA integrazione ^{14, 15, 16, 17.} Tuttavia, a differenza di infezione naturale, questa reazione biochimica in vitro non supporta l'integrazione concertata di entrambe le estremità del DNA substrato nel DNA bersaglio. Al contrario, i PIC retrovirali isolate da cellule con infezione acuta concertata integrano entrambe le estremità della vDNA endogena nel DNA bersaglio eterologo. Ciò ha portato alla diffusa adozione e le successive raffinatezze di saggi in vitro Integration (IVI) I n usando isolati PIC nativi.

Nel primo saggio riportato retrovirale IVI, estratti citoplasmatici di cellule infettate con un murino ricombinanteLeukemia Virus (MLV) ospitare il gene E. coli supF nella sua LTR servito come fonte di attività IN, e il DNA di fago lambda mutante difettoso in crescita litico fu esogenamente forniti come il DNA bersaglio. Successful integrazione del ricombinante MLV DNA copia nel DNA fagico e l'espressione conseguente supF portato al ripristino della capacità di formazione di placca dei fagi ricombinanti. Tuttavia, questa strategia sperimentale è laboriosa e misure di integrazione in maniera indiretta. Per far fronte a tali avvertimenti, un test indiretto end-etichettatura Southern Blot-based, che quantifica l'attività IVI PIC-associata come misura della vDNA endogena integrato in esogeni batteriofago linearizzato phiX174 DNA, è stato sviluppato ^{6, 7, 18.} Anche se questo metodo fornisce una misura diretta di eventi di integrazione, sono necessarie quantità relativamente elevate di preparazione PIC, che rimane tecnicamente difficilesforzo. Per aggirare questo, sono stati sviluppati test basati sulla PCR nested che richiedono solo modeste quantità di PIC ^{4, 5, 19.}

In questo rapporto, descriviamo una versione aggiornata di un nested PCR-based metodo in vitro ideato per ricapitolare l'attività di integrazione di HIV-1 PIC-mediata che si verificano durante l'infezione naturale. Questo metodo utilizza gli estratti citoplasmatici delle cellule bersaglio HIV-1-infetti come fonte di attività PIC endogena, che viene misurata con un tempo reale Polymerase Chain Reaction quantitativa (qPCR). Le procedure per isolare PIC e misurare le loro attività di integrazione sono adattati, con modificazioni, dalla protocolli pubblicati dal laboratorio Engelman ^20. In questo metodo, l'attività di integrazione PIC-associato viene avviato fornendo un target DNA esogeno lineari ^21, ed i prodotti di DNA risultanti dallaquesta reazione integrazione sono purificate e utilizzato come materiale di partenza per la quantificazione successiva basata sulla PCR. Nel primo turno convenzionale PCR, le giunzioni del DNA virale bersaglio sono amplificati utilizzando primer appropriati. Nel secondo turno qPCR, primer LTR-specifici vengono utilizzati per arricchire specificamente la popolazione vDNA dal primo turno di PCR prodotti. Vedere la sezione protocollo per una descrizione dettagliata di questo metodo.

Studi in vitro con PIC retrovirali hanno portato a significativi progressi nella nostra comprensione del meccanismo di integrazione del DNA retrovirale e nello sviluppo di inibitori IN. Sulla base della recente maggiore attenzione alla mappatura di HIV-1 siti di integrazione, determinare il ruolo dei fattori virali e dell'ospite in HIV-1 integrazione e lo sviluppo di nuovi farmaci antivirali alla lotta contro la resistenza ai farmaci, prevediamo un crescente interesse e l'uso diffuso di IVI saggi , come quello descritto in questa relazione. Questo, a sua volta, porterà afuturi perfezionamenti nel metodo, diversificando in tal modo la portata delle sue applicazioni.

Protocol

1. Virus Produzione NOTA: Per generare alti titoli di contagioso dell'HIV-1, trasfezione la linea cellulare embrionale umano Rene (HEK) 293T con un contagioso dell'HIV-1 clone molecolare utilizzazione di un reagente di trasfezione dendrimeri basati attivato. È stato osservato che il metodo del calcio fosfato trasfezione produce risultati comparabili. In un laboratorio di biosicurezza di livello 2 (BSL2), semi di 3 x 10 6 293T cellule per 10 centimetri piatto di…

Representative Results

L'isolamento del virus HIV-1 PIC Uno schema del protocollo usato per l'isolamento del virus HIV-1 PIC da cellule SUP-T1 infezione acuta è illustrato in Figura 1. Questo protocollo è derivato dai metodi descritti da Engelman et al. 19, 20. HIV-1 PIC sono complessi nucleoproteici che vengono assemblati nelle cellule in…

Discussion

analisi biochimiche di PIC retrovirali hanno fornito spunti critici nel meccanismo di integrazione del DNA retrovirale. Misurazione dell'attività integrazione dei PIC retrovirali può essere ottenuto mediante saggio di placca formazione, analisi Southern blot, e nested qPCR. La strategia sperimentale del saggio di placca è laboriosa e utilizza un metodo indiretto per misurare integrazione ^{6, 7, 18.} Southern integrazione t…

Materials

Fetal bovine serum (FBS)	GIBCO/Invitrogen	10437-028
Heat-inactivated Fetal bovine serum (Hi-FBS)	GIBCO/Invitrogen	10438-026
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	GIBCO/Invitrogen	11995-065
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium	GIBCO/Invitrogen	11875-093
Phosphate buffered saline (PBS) (1X)	GIBCO/Invitrogen	20012-027
Trypsin-EDTA (0.25%)	GIBCO/Invitrogen	25200-056
Penicillin-Streptomycin solution (100x)	Cellgro/Mediatech	30-002-CI
HEK293T cells (293T)	American Type Culture Collection (ATCC)	CRL-3216
HIV-1 proviral molecular clone pNL4-3	NIH AIDS Research and Reference Reagent Program	114
PolyFect transfection reagent	Qiagen	301107
DNase	Calbiochem/Merckmillipore	260913
Immulon 2HB 96-well plates	Thermo Scientific	3455
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
ELISA coating antibody: anti-CA-183-H12-5C monoclonal antibody	NIH AIDS Research and Reference Reagent Program	1513
ELISA wash solution (0.2% Tween-20 in PBS)	—	—
Donor bovine serum	Gibco/Invitrogen	16030074
Blocking Buffer (5% donor bovine serum in PBS) – Prepare fresh before use.	—	—
Sample diluent (SD) buffer (10% donor bovine serum and 0.5% Triton X-100 in PBS) – Sterilize using 0.22 micron pore-size syringe filter and store aliquots at 4°C.	—	—
Recombinant p24 protein (Full-length CA protein was expressed from pET21a-CA plasmid in E. coli BL21-DE3 and purified as described in Ref # —-)	Dr. Wesley Sundquist	—
HIV IgG	NIH AIDS Research and Reference Reagent Program	3957
Goat anti-human IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, HRP conjugate	Pierce/ThermoFisher	31412
TMB Microwell Peroxidase substrate system	KPL, Inc.	50-76-00
SupT1 cells	American Type Culture Collection (ATCC)	CRL-1942
HEPES pH 7.2-7.5 (ready-to-use solution)	GIBCO/Invitrogen	15630-080
Potassium chloride (KCl) solution	Sigma-Aldrich	60142
Magnesium chloride (MgCl2) solution	Sigma-Aldrich	M1028
Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	43815
Aprotinin	Sigma-Aldrich	A6106
Digitonin	Sigma-Aldrich	D141
RNase A	Invitrogen	12091-021
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
phiX174 Replicative Form 1 DNA	Promega	D1531
PhiX174-F primer: 5’-CGCTTCCATGACGCAGAAGTT-3’ PhiX174-R primer: 5’-CACTGACCCTCAGCAATCTTA-3’	Invitrogen and/or IDT-DNA
dNTP mix	Promega	U1515
Go Taq DNA Polymerase	Promega	M3005
Qiaquick gel extraction kit	Qiagen	28706
Ultrapure distilled water	Invitrogen	10977-015
Tris-EDTA (TE) buffer (100X)	Sigma-Aldrich	T9285
Sodium dodecyl sulphate (SDS)	Sigma-Aldrich	L3771
Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt (EDTA) solution, 0.5 M, pH 8.0	Sigma-Aldrich	E7889
Proteinase K (20 mg/ml ready-to-use solution)	Qiagen	19131
Phenol (equilibrated with 10 mM Tris HCl, pH 8.0 and 1 mM EDTA)	Sigma-Aldrich	P4557
Chloroform	Sigma-Aldrich	288306
Glycogen (5 mg/ml solution)	Ambion/Invitrogen	AM9510
Sodium acetate (3M, pH 5.2)	Sigma-Aldrich	57899
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023
First round LTR primer: 5’-GTGCGCGCTTCAGCAAG-3’) First round phiX174 primer: 5’-CACTGACCCTCAGCAATCTTA-3’	Invitrogen and/or IDT-DNA	—
Second round LTR-R primer: 5’-TCTGGCTAACTAGGGAACCCA-3’ Second round LTR-U primer: 5’-CTGACTAAAAGGGTCTGAGG-3’; Second round Taqman probe:  5’-56– FAM/TTAAGCCTCAATAAAGCTTGC CTTGAGTGC/36-TAMRA/-3’	Invitrogen and/or IDT-DNA	—
iQ Supermix	Bio-Rad	170-8862