Изоляция, дифференцировку и Количественная человеческого антитела секретирующие В-клетки из крови: Elispot в качестве функционального считывания показаний гуморального иммунитета
Summary
Human peripheral blood is commonly used for the assessment of the humoral immune response. Here, the methods for isolating human B cells from peripheral blood, differentiating human B cells into antibody (Ab)-secreting B cells (ASCs) in culture, and enumerating the total IgM- and IgG-ASCs via an ELISpot assay are described.
Abstract
Отличительной чертой гуморального иммунитета является создание функциональных ИСС, которые синтезируют и секретируют Abs, специфичное к антигену (Ag), такие, как патогена, и используются для защиты хозяина. Для количественного определения функционального состояния гуморального иммунного ответа индивидуума, и сывороткой Абс и циркулирующие ИСС обычно измеряется в качестве функциональных считываниями. В организме человека в периферической крови является наиболее удобным и легко доступны образцы, которые могут быть использованы для определения гуморального иммунного ответа, вызываемого хозяином В-клеток. Четкие B-клеточные подмножества, в том числе ИСС, могут быть выделены непосредственно из периферической крови с помощью селекции с использованием линии дифференцировки специфических Ab-сопряженными микрошариков или через сортировки клеток с проточной цитометрии. Кроме того, очищенные наивные и В-клетки памяти могут быть активированы и дифференцированы в ИСС в культуре. Функциональной активности ИСС, чтобы способствовать секреции Ab может быть определена количественно с помощью ELISpot, который представляет собой анализ, который сходится фермент-связанной анализ immunoabsorbance (ИФА) и западные технологии блоттинга для того, чтобы перечисление отдельных ИСС на уровне одной клетки. На практике анализ ELISpot чаще используется для оценки эффективности вакцины из-за легкости в обращении большого количества образцов крови. Способы выделения клеток человека из периферической крови, дифференцировка В – клеток в ИСС в лабораторных условиях , а также применение ELISpot для количественного определения общего IgM- и IgG-ИСС будет описана здесь.
Introduction
В-клетки играют центральную роль в развитии гуморального иммунитета. Они изначально развиваются в костном мозге и попадает в кровь в виде наивных В-клеток, которые могут мигрировать в лимфоидные ткани, такие как селезенка, лимфатические узлы, а также миндалин, для дальнейшего развития. При столкновении Ag, некоторые наивные В-клетки мигрируют в лимфоидные фолликулы, где зародышевых центр В-клетки могут дифференцироваться в В-клетки памяти и plasmablasts (УБ) / плазмоцитов (ПК). В то время как большинство ФБФР / ПК EGRESS в поток крови, несколько в конечном счете находятся в костном мозге , чтобы пройти терминальной дифференцировки в долгоживущих ПК 1. В – клетки , находящиеся в обращении являются гетерогенными, и в стационарном состоянии, ФБФР / ПК редки в периферической крови 2. В результате наличия поверхностных маркеров линии дифференцировки специфических, проточной цитометрии стало популярным методом для идентификации и характеристики подмножеств В-клеток в периферической крови. Расширенное применение cytometr потокаY является добавление функции сортировки клеток, что позволяет разделение и выделение отдельных подмножеств В-клеток с высокой степенью чистоты. На основе экспрессии специфических рецепторов на поверхности на разных стадиях развития, человека , циркулирующие В – клетки , как правило , подразделяются на три основных субпопуляций: наивных В – клеток (CD19 + CD27 – CD38 -), В – клетки памяти (CD19 + CD27 + CD38 -), и ФБФР / ПК (CD19 + CD27 + CD38 +) 3-4 (Рисунок 1). Наивные В-клетки по своей природе не сталкивались с АГС. Тем не менее, они могут быть дифференцированы в клетки IgM + CD27 + память B. Несмотря на то, наивные В – клетки являются однородными в выражении антиген В-клеточный рецептор (BCR) -associated молекулы (например, CD19, CD20 и CD22) , они неоднородны в своем репертуаре 5 иммуноглобулина. Большинство клеток CD27 + память B могут быть дифференцированы в CD27+ / CD38 + привет ФБФР / ПК 6. Кроме того, В – клетки памяти и ФБФР / ПК поликлональные и демонстрируют с развитием и функциональной гетерогенности 4-7. ФБФР / ПК в обращении, как правило, недолговечны и не выражают CD138, но сделанные осесть в костном мозге будет терминально дифференцируются и долговечны. Терминально дифференцированных ПК выражают CD138 и понижающей регуляции молекулы CD27 на их поверхности 8. Так как УБ и ПК способны секретировать Abs, во многих случаях они все вместе обозначаются как ИСС. В противоположность этому , ни наивным , В – клетки , ни В – клетки памяти может произвести значительные количества Abs 9-10. Тем не менее, при выделении, как наивные и В – клетки памяти могут быть дифференцированы в ИСС в течение 3 – 10 дней при помещении в соответствующих условиях культивирования 6, 11-15. На самом деле, ИСС происходит от в пробирке дифференциации доля подобных поверхностных проявлений CD27 и CD38 с теми , непосредственно выделенных фром периферической крови 6. Кроме того, ИСС дифференцировались в пробирке экспрессируют низкий уровень поверхности CD20, подобный что циркулирующих ФБФР / ПК 6. Хотя культура происхождения ИСС все недолговечны, они могут секретируют Abs, указывая, что они функционально компетентной и способной внести свой вклад в гуморального иммунитета.
Оба ELISA и ELISpot являются на сегодняшний день наиболее часто применяются методы, с помощью которых получить функциональную информацию о гуморального иммунного ответа. ИФА 96-луночный планшет на основе анализа а, и он часто используется для измерения титры сывороточного АГ-специфических антител и других аналитов (например, цитокины). Это удобно и масштабируемым. ИФА предназначен для использования анализа твердофазного фермента , чтобы обнаружить присутствие антител или других веществ, таких как сыворотка, в жидком образце 16. Показаниями из сыворотки ELISAs широко используется для представления иммунный ответ организма. Инструмент, необходимый для приобретения повторногоadouts из ИФА является спектрофотометрический микропланшет-ридера. Читателю может определить оптическую плотность (ОП) конечных продуктов , как правило , в результате реакции с пероксидазой хрена (HRP) Абс обнаружения и их специфических субстратов 17. Что касается отчетности гуморальный иммунный ответ, сывороточные уровни Ab, определенные методом ELISA обозначают коллективный, а не индивидуальный, производительность ИСС в организме. Кроме того, ИФА не принимает во внимание участие В-клетками памяти, которые не секретируют Abs.
Как ELISA, ELISpot является широко используемым методом для обнаружения и мониторинга иммунного ответа в образцах периферической крови 17-18. ELISpot представляет собой метод, связанные с бутербродом ELISA. В нем, клетки помещают в поливинилиденфторида (ПВДФ) Мембранный спинками лунки 96-луночных микропланшетов для кратковременной культуры. Анализ ELISpot аналогично выполнения вестерн-блоттинга на микропланшет и developinг пятна на PVDF мембрану в каждую лунку. Автоматизированная система для чтения ELISpot или стереомикроскоп для ручного подсчета требуется. Основное преимущество ELISpot в обнаружении иммунного ответа является его превосходная чувствительность в квантификации ИСС и цитокин-секретирующие клетки. Он сообщает их функциональную активность в гуморального и клеточного иммунитета, соответственно. При измерении гуморальной иммунной функции, уровни сывороточного Ab , определенные методом ELISA , и количество ИСС , перечисляемые ELISpot часто коррелируют, но показания данные из этих двух анализов имеют некоторые различия в функциональных последствий 19-20. Основным преимуществом ELISpot является его чувствительность метода. Уровень сывороточного титра Ab как сообщает ELISA представлены полуколичественно, как OD считываний, обозначающее относительный уровень Ab, или более количественно, так как концентрация считываний, когда известное количество правильных изотипов Abs включена для справки. В отличие от этого, результаты ELISpot являются Presented в качестве абсолютного числа ИСС в пуле клеток , представляющих интерес (например, нефракционированные одноядерные клетки периферической крови (РВМС) и очищенные В – клетки из МНПК). ELISpot может обнаружить одну ASC, но ELISA требует количества Ab от ИСС достичь оптимизированной опробования зависящих от концентрации перед измерением. Следовательно, ELISpot явно превосходит ELISA в чувствительности количественного определения. Кроме того, ELISpot также подходит для количественного определения in vitro на дифференцированные ИСС из активированных В – клеток памяти. Память В-клетки не секретируют Abs, но могут дифференцироваться в ИСС при активации; поэтому они не имеют никакого вклада в сыворотке крови антител, обнаруженных ELISA. Таким образом, ELISpot является методом выбора при измерении иммунного ответа циркулирующих В-клеток памяти после активации в культуре. Это позволяет осуществлять мониторинг содержания долгосрочного гуморального иммунитета.
Protocol
Representative Results
Discussion
Выделение и очистка периферической крови человека В-клеток
Обычно Эритроциты могут быть эффективно разорваны и очищается буфера для лизиса (шаг 1.2). Важно, чтобы не инкубировать МНПК с буфером для лизиса эритроцитов дольше, чем 5 мин, а жизнеспособность клеток может зависе…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by a research grant from the Ministry of Science and Technology of the Executive Yuan of Taiwan (NSC99-2320-B-002-011). I would like to acknowledge the excellent service provided by the Flow Cytometric Analyzing and Sorting Core of the First Core Laboratory in College of Medicine of National Taiwan University.
Materials
| BD Vacutainer K2E | BD Biosciences | 367525 | 10 ml tube |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | endotoxin-free |
| Trypan blue 0.5% solution | Biological Industries | 03-102-1B | |
| IMag Human B lymphocyte enrichment set | BD Biosciences | 558007 | |
| Biotinylated CD27 mAb | Biolegend | 302804 | clone O323 |
| Streptavidin magnetic microbeads | BD Biosciences | 9000810 | |
| 15 ml Falcon tubes | BD Falcon | 352196 | |
| Blue nylon mesh cell strainer, 40 μm | BD Falcon | 352340 | |
| Anti-human CD19-APC | Biolegend | 302212 | clone HIB19 |
| Anti-human CD27-eFluor 450 | eBioscience | 48-0279-42 | clone O323 |
| Anti-human CD38-PE-Cy7 | Biolegend | 303516 | clone HIT2 |
| Anti-human CD38-PE-Cy7 | BD Biosciences | 560677 | clone HIT2 |
| Anti-human CD45-FITC | Biolegend | 304006 | clone HI30 |
| Anti-human CD45-FITC | BD Biosciences | 555482 | clone HI30 |
| Anti-mouse/rat/human CD27-PerCP Cy5.5 | Biolegend | 124213 | clone LG.3A10 |
| Anti-human CD27-PerCP Cy5.5 | BD Biosciences | 65429 | clone L128 |
| Anti-human CD19-FITC | Miltenyi Biotec | 130-098-064 | clone LT19 |
| Anti-human CD19-FITC | GeneTex | GTX75599 | clone LT19 |
| Anti-human CD20-FITC | BD Biosciences | 555622 | clone 2H7 |
| biotinylated anti-human CD27 | Biolegend | 302804 | clone O323 |
| biotinylated anti-human CD27 | eBioscience | 13-0279-80 | clone O323 |
| 7-aminoactinomycin D (7-AAD) | BD Biosciences | 559925 | |
| CpG (ODN 2006) | InvivoGen | tlrl-2006 | type B CpG |
| Recombinant human IL-2 | PeproTech | 200-02 | |
| Recombinant human IL-10 | PeproTech | 200-10 | |
| Recombinant human IL-21 | PeproTech | 200-21 | |
| Recombinant human sCD40L | PeproTech | 310-02 | |
| Protein A of S. aureus Cowan (SAC) | Sigma-Aldrich | 82526 | |
| Pokeweed mitogen (PWM) | Sigma-Aldrich | L9379 | |
| MultiScreen filter plates, 0.45 µm pore size | Merck Millipore | MSIPS4510 | sterile, clear 96-well filter plate with hydrophobic PVDF membrane |
| BCIP/NBT solution | Sigma-Aldrich | B6404 | |
| BCIP/NBT single reagent, alkaline phosphatase substrate | Merck Millipore | ES006 | |
| Human IgG | Jackson ImmunoResearch | 009-000-003 | |
| Human IgG, Fc fragment | Jackson ImmunoResearch | 009-000-008 | |
| F(ab')2 fragment of goat anti-human Ig (IgG+IgM+IgA) | Jackson ImmunoResearch | 109-006-127 | |
| Goat anti-human IgG-alkaline phosphatase, Fcγ fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 109-055-008 | |
| Goat anti-human IgM-alkaline phosphatase, Fcµ fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 109-055-095 | |
| Goat anti-human IgG-peroxidase, Fcγ fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 109-035-008 | |
| Goat anti-human IgM-peroxidase, Fcµ fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 109-035-095 | |
| BD ELISPOT AEC substrate kit | BD Biosciences | 551951 | |
| C.T.L. ImmunoSpot analyzer | C.T.L. |
References
- Bemark, M. Translating transitions – how to decipher peripheral human B cell development. J. Biomed. Res. 29 (4), 264-284 (2015).
- Odendahl, M., et al. Generation of migratory antigen-specific plasmablasts and mobilization of resident plasma cells in a secondary immune response. Blood. 105 (4), 1614-1621 (2005).
- Jackson, S. M., Wilson, P. C., James, J. A., Capra, J. D. Human B cell subsets. Adv. Immunol. 98, 151-224 (2008).
- Sanz, I., Wei, C., Lee, F. E., Anolik, J. Phenotypic and functional heterogeneity of human memory B cells. Semin. Immunol. 20 (1), 67-82 (2008).
- Perez-Andres, M., et al. Human peripheral blood B-cell compartments: A crossroad in B-cell traffic. Cytometry B Clin. Cytom. 78 (Suppl 1), S47-S60 (2010).
- Huggins, J., et al. CpG DNA activation and plasma-cell differentiation of CD27- naïve human B cells. Blood. 109 (4), 1611-1619 (2007).
- Wu, Y. C., Kipling, D., Dunn-Walters, D. K. The relationship between CD27 negative and positive B cell populations in human peripheral blood. Front. Immunol. 2, 81 (2011).
- Maïga, R. I., Bonnaure, G., Rochette, J. T., Néron, S. Human CD38hiCD138⁺ plasma cells can be generated in vitro from CD40-activated switched-memory B lymphocytes. J. Immunol. Res. 2014, 635108 (2014).
- Wienands, J., Engels, N. The memory function of the B cell antigen receptor. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 393, 107-121 (2016).
- Kurosaki, T., Kometani, K., Ise, W. Memory B cells. Nat. Rev. Immunol. 15 (3), 149-159 (2015).
- Tzeng, S. J., Li, W. Y., Wang, H. Y. FcγRIIB mediates antigen-independent inhibition on human B lymphocytes through Btk and p38 MAPK . J. Biomed. Sci. 22, 87-98 (2015).
- Ettinger, R., et al. IL-21 induces differentiation of human naïve and memory B cells into antibody-secreting plasma cells. J. Immunol. 175 (12), 7867-7879 (2005).
- Bekeredjian-Ding, I., Foermer, S., Kirschning, C. J., Parcina, M., Heeg, K. Poke weed mitogen requires Toll-like receptor ligands for proliferative activity in human and murine B lymphocytes. PLoS One. 7 (1), e29806 (2012).
- Bernasconi, N. L., Traggiai, E., Lanzavecchia, A. Maintenance of serological memory by polyclonal activation of human memory B cells. Science. 298 (5601), 2199-2202 (2002).
- Defrance, T., Vanbervliet, B., Brière, F., Durand, I., Rousset, F., Banchereau, J. Interleukin 10 and transforming growth factor beta cooperate to induce anti-CD40-activated naive human B cells to secrete immunoglobulin A. J. Exp. Med. 175 (3), 671-682 (1992).
- Hornbeck, P., Fleisher, T. A., Papadopoulos, N. M., Coligan, J. E. Chapter 2, Unit 2.2, Isotype determination of antibodies. Current Protocols in Immunology. , (2001).
- Tanguay, S., Killion, J. J. Direct comparison of ELISPOT and ELISA-based assays for detection of individual cytokine-secreting cells. Lymphokine Cytokine Res. 13 (4), 259-263 (1994).
- Crotty, S., Aubert, R. D., Glidewell, J., Ahmed, R. Tracking human antigen-specific memory B cells: a sensitive and generalized ELISPOT system. J. Immunol. Methods. 286 (1-2), 111-122 (2004).
- Zhang, Y., Wang, Y., Zhang, M., Liu, L., Mbawuike, I. N. Restoration of retarded influenza virus-specific immunoglobulin class switch in aged mice. J. Clin. Cell. Immunol. 7 (2), 403 (2016).
- Doedée, A. M., Kannegieter, N., Öztürk, K., van Loveren, H., Janssen, R., Buisman, A. M. Higher numbers of memory B-cells and Th2-cytokine skewing in high responders to hepatitis B vaccination. Vaccine. 34 (19), 2281-2289 (2016).
- Heine, G., Sims, G. P., Worm, M., Lipsky, P. E., Radbruch, A., Coligan, J. E. Chapter 7, Unit 7.5, Isolation of human B cell populations. Current Protocols in Immunology. , (2011).
- Safarík, I., Safaríková, M. Use of magnetic techniques for the isolation of cells. J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl. 722 (1-2), 33-53 (1999).
- Morbach, H., Eichhorn, E. M., Liesem, J. G., Girschickm, H. J. Reference values for B cell subpopulations from infancy to adulthood. Clin. Exp. Immunol. 162 (2), 271-279 (2010).
- Thornton, A. M., et al., Coligan, J. E., et al. Chapter 3, Unit 3.5A, Fractionation of T and B cells using magnetic beads. Current Protocols in Immunology. , (2003).
- Klein, U., Rajewsky, K., Küppers, R. Human immunoglobulin (Ig)M+IgD+ peripheral blood B cells expressing the CD27 cell surface antigen carry somatically mutated variable region genes: CD27 as a general marker for somatically mutated memory)Bcells. J.Exp. Med. 188 (9), 1679-1689 (1998).
- Bohnhorst, J. &. #. 2. 1. 6. ;., Bjørgan, M. B., Thoen, J. E., Natvig, J. B., Thompson, K. M. Bm1-Bm5 classification of peripheral blood B cells reveals circulating germinal center founder cells in healthy individuals and disturbance in the B cell subpopulations in patients with primary Sjögren’s syndrome. J. Immunol. 167 (7), 3610-3618 (2001).
- Bleesing, J. J., et al., Coligan, J. E., et al. Chapter 7, Unit 7.35, Assays for B cell and germinal center development. Current Protocols in Immunology. , (2003).
- Horvatinovich, J. M., Sparks, S. D., Mann, K. P. Establishing a pure lymphocyte gate for subset analysis by flow cytometry. Cytometry. 26 (2), 172-177 (1996).
- Ruprecht, C. R., Lanzavecchia, A. Toll-like receptor stimulation as a third signal required for activation of human naive B cells. Eur. J. Immunol. 36 (4), 810-816 (2006).
- Smith, K., et al. Rapid generation of fully human monoclonal antibodies specific to a vaccinating antigen. Nat. Protoc. 4 (3), 372-384 (2009).
- Caraux, A., et al. Circulating human B and plasma cells. Age-associated changes in counts and detailed characterization of circulating normal CD138- and CD138+ plasma cells. Haematologica. 95 (6), 1016-1020 (2010).
- Kuchen, S., Robbins, R., Sims, G. P., Sheng, C., Phillips, T. M., Lipsky, P. E., Ettinger, R. Essential role of IL-21 in B cell activation, expansion, and plasma cell generation during CD4+ T cell-B cell collaboration. J. Immunol. 179 (9), 5886-5896 (2007).
- Pinna, D., Corti, D., Jarrossay, D., Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Clonal dissection of the human memory B-cell repertoire following infection and vaccination. Eur. J. Immunol. 39 (5), 1260-1270 (2009).
- Jahnmatz, M., et al. Optimization of a human IgG B-cell ELISpot assay for the analysis of vaccine-induced B-cell responses. J. Immunol. Methods. 391 (1-2), 50-59 (2013).
- Weiss, G. E., et al. High efficiency human memory B cell assay and its application to studying Plasmodium falciparum-specific memory B cells in natural infections. J. Immunol. Methods. 375 (1-2), 68-74 (2012).
- Leehan, K. M., Koelsch, K. A. T Cell ELISPOT: For the identification of specific cytokine-secreting T cells. Methods. Mol. Biol. 1312, 427-434 (2015).
- Karahan, G. E., et al. Quantification of HLA class II-specific memory B cells in HLA-sensitized individuals. Hum. Immunol. 76 (2-3), 129-136 (2015).
- Hadjilaou, A., Green, A. M., Coloma, J., Harris, E. Single-cell analysis of B cell/antibody cross-reactivity using a novel multicolor FluoroSpot assay. J. Immunol. 195 (7), 3490-3496 (2015).
- Janetzki, S., Rueger, M., Dillenbeck, T. Stepping up ELISpot: multi-level analysis in FluoroSpot assays. Cells. 3 (4), 1102-1115 (2014).
- Alatrakchi, N., Graham, C. S., He, Q., Sherman, K. E., Koziel, M. J. CD8+ cell responses to hepatitis C virus (HCV) in the liver of persons with HCV-HIV coinfection versus HCV monoinfection. J. Infect. Dis. 191 (5), 702-709 (2005).
- Smith, S. G., et al. Identification of major factors influencing ELISpot-based monitoring of cellular responses to antigens from Mycobacterium tuberculosis. PLoS. One. 4 (11), e7972 (2009).
- Sundararaman, S., et al. High reproducibility of ELISPOT counts from nine different laboratories. Cells. 4 (1), 21-39 (2015).
- Janetzki, S., et al. Guidelines for the automated evaluation of Elispot assays. Nat. Protoc. 10 (7), 1098-1115 (2015).
